弓形虫MORN2基因敲除株的构建及其表型鉴定

作     者：陈凯 王金磊 白梦捷 杨文彬 黄思扬 CHEN Kai;WANG Jinlei;BAI Mengjie;YANG Wenbin;HUANG Siyang

作者机构：中国农业科学院兰州兽医研究所兰州730030 家畜疫病病原生物学国家重点实验室兰州730030 西北农林科技大学动物医学院杨凌712100 

基　　金：国家自然科学基金项目(31472184) 

出 版 物：《中国畜牧兽医》 (China Animal Husbandry & Veterinary Medicine)

年 卷 期：2018年第45卷第9期

页      码：2386-2393页

摘      要：本研究旨在构建弓形虫(Toxoplasma gondii)Ⅰ型RH虫株的膜占位与识别联结蛋白2(membrane occupation and recognition nexus protein,MORN2)基因敲除株,探究MORN2基因的表型功能。利用CRISPR/Cas9技术在sgRNA设计网站筛选出以MORN2基因为靶标的sgRNA并设计引物,以pSAG1∷CAS9-U6∷sgUPRT质粒为模板,在Q5酶作用下构建出MORN2靶向CRISPR的质粒;在MORN2靶点两翼约500bp设计同源臂引物,以pUPRT∷DHFR-D质粒为模板构建含有乙胺嘧啶药物抗性基因(DHFR)的同源片段;将CRISPR质粒与同源片段电转染到弓形虫速殖子中,进行乙胺嘧啶药物筛选、96孔板单克隆筛选及PCR鉴定。结果显示,试验成功获得MORN2基因敲除株,在体外噬斑试验中,该敲除株的生长速度与野生型RH虫株基本一致;在体内感染试验中,分别以100和1 000个敲除株的速殖子腹腔注射小鼠,小鼠的死亡时间与对照组基本一致,说明MORN2基因的缺失几乎不影响RH虫株在体外培养时的生长速度和感染小鼠的毒力。本研究证明了MORN2基因在RH虫株中无表型功能,为进一步探究弓形虫的功能基因奠定了基础。

主 题 词：弓形虫 CRISPR/Cas9 MORN 2基因 基因敲除 

学科分类：090601[090601] 09[农学] 0906[农学-水产类] 

D　O　I：10.16431/j.cnki.1671-7236.2018.09.005

馆 藏 号：203373564...