黑曲霉糖化酶基因的克隆及其在毕赤酵母X33中的表达

作     者：曹慕琛 徐健勇 罗立超 张同存 孙劭靖 宋诙 

作者机构：天津科技大学生物工程学院教育部工业微生物重点实验室天津市工业微生物重点实验室天津300457 天津工业生物技术研究所基因工程与微生物应用技术研究组天津300308 中国农业大学生物学院天津300308 

出 版 物：《安徽农业科学》 (Journal of Anhui Agricultural Sciences)

年 卷 期：2011年第39卷第14期

页      码：8226-8230,8306页

摘      要：[目的]以毕赤酵母（Pichia pastoris）X33为宿主菌高效表达黑曲霉（Aspergillus niger）糖化酶,为进一步扩大糖化酶在工业上的应用奠定基础。[方法]利用RT-PCR技术,提取黑曲霉总RNA进行反转录,以得到的cDNA为模板,根据NCBI数据库中***513.88糖化酶的cDNA序列（glaA）设计引物,通过PCR扩增得到去除天然信号肽的糖化酶成熟肽编码基因glaAm,并将其克隆到pUC19载体中,序列分析表明,glaAm的开放阅读框由1 879个核苷酸组成,编码625个氨基酸。以此片段构建了pFLDα-glaAm重组表达载体,经NsiI线性化后,电击转化毕赤酵母X-33。摇瓶培养中通过添加终浓度为0.5%的甲醇诱导糖化酶的分泌。[结果]SDS-PAGE和Starch-PAGE显示,糖化酶得到正确的分泌表达,且具有较高的生物活性,发酵上清液中酶活最高达到380.78 U/ml（发酵液）。重组糖化酶的最适反应温度和最适pH分别为6065℃和4.0,在pH2.55.5范围内均保持90%以上的酶活力。该酶具有较高的热稳定性,pH4.0条件下,该酶在50℃下稳定;60℃处理60 min,仍能保持90%以上的酶活力;65℃下的半衰期约为44 min。[结论]黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母X33中得到了异源高效表达。

主 题 词：毕赤酵母 糖化酶 热稳定性 异源表达 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 0828[工学-建筑类] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 

D　O　I：10.3969/j.issn.0517-6611.2011.14.014

馆 藏 号：203380113...