利用CRISPR/Cas9技术构建VPS34基因敲除的A549/293T细胞系

作     者：刘玉兰 李娅慧 张宜娜 刘斐 胡伯里 周继勇 Liu Yulan;Li Yahui;Zhang Yina;Liu Fei;Hu Boli;Zhou Jiyong

作者机构：南京农业大学动物医学院南京210095 浙江大学动物科学学院杭州310058 

基　　金：国家自然科学基金重点项目(批准号:31630077)资助的课题~~ 

出 版 物：《中国细胞生物学学报》 (Chinese Journal of Cell Biology)

年 卷 期：2018年第40卷第10期

页      码：1719-1726页

摘      要：该研究利用CRISPR/Cas9策略构建敲除VPS34基因的A549/293T细胞系,并初步将其用于自噬功能研究。应用在线工具设计了针对VPS34基因的3条sgRNA,并克隆至pX459载体。将重组质粒转染A549/293T细胞,嘌呤霉素初步筛选,通过PCR后测序和Western blot技术检测发现, sgRNA-1的敲除效果最好。将转染sgRNA-1的两种细胞单克隆化, PCR测序发现,存在碱基缺失, Western blot结果显示,对应的单克隆也未检测到VPS34蛋白,可见成功获得了VPS34敲除的A549/293T细胞系。由于VPS34参与自噬起始,实验结果显示, VPS34敲除后, LC3-I向LC3-II转化显著被抑制,自噬底物P62大量累积。结果表明,该方法成功获得稳定敲除VPS34基因的A549/293T细胞系,且细胞中的自噬被显著抑制。同时,敲除VPS34能够降低人肺癌A549细胞的生长速率。该实验利用CRISPR/Cas9系统首次获得稳定敲除VPS34基因的哺乳动物细胞A549/293T细胞系,为后续自噬功能研究提供有力工具。

主 题 词：CRISPR/Cas9系统 VPS34 基因敲除 单克隆细胞 自噬 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 

核心收录：

D　O　I：10.11844/cjcb.2018.10.0101

馆 藏 号：203390044...