利用同源重组技术构建DKK1、BMP4真核表达载体及共转染成纤维细胞表达的研究

作     者：张梦瑶 杨峰 刘开东 刘积凤 贺建宁 柳楠 ZHANG Mengyao;YANG Feng;LIU Kaidong;LIU Jifeng;HE Jianning;LIU Nan

作者机构：青岛农业大学动物科技学院山东青岛266109 内蒙古农业大学内蒙古呼和浩特010018 青岛畜牧兽医研究所山东青岛266121 

基　　金：国家自然科学基金项目(31402047) 国家绒毛用羊产业技术体系专项资金(CARS-39-05) 青岛农业大学高层次人才科研基金(631410) 

出 版 物：《华北农学报》 (Acta Agriculturae Boreali-Sinica)

年 卷 期：2018年第33卷第5期

页      码：117-124页

摘      要：为了构建敖汉细毛羊DKK1、BMP4基因真核表达载体及单、共转染成纤维细胞后研究两基因表达量之间的变化,以敖汉细毛羊为研究对象,采集40日龄的胎羊。首先,通过RNA的提取反转录成c DNA参照Gen Bank中DKK1、BMP4基因序列信息分别设计1对含有同源臂的引物,通过PCR反应扩增获得DKK1、BMP4基因片段、利用So So试剂盒将目的片段连接到pcDNA3. 1真核表达载体上。鉴定正确后的pcDNA3. 1-DKK1、pcDNA3. 1-BMP4重组质粒,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞;其次对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的pcDNA3. 1-DKK1、pcDNA3. 1-BMP4单、共转染成纤维细胞,利用荧光定量PCR技术和Western Blot技术检测DKK1、BMP4基因单转染和共转染在成纤维细胞中表达量的变化。结果显示,经酶切、测序鉴定pcDNA3. 1-DKK1、pcDNA3. 1-BMP4构建成功,成纤维细胞原代、传代培养良好,转染后细胞生长良好,经实时荧光定量PCR技术和Western Blot检测DKK1基因共转染成纤维细胞较单转染的表达量极显著下降(P <0. 01),BMP4基因的共转染较单转染表达量没有发生明显变化。成功构建了敖汉细毛羊DKK1、BMP4基因的真核表达载体,并且成功共转染成纤维细胞,DKK1基因的表达量明显下降,BMP4基因的表达量没发生明显变化,因而,推断BMP4基因抑制了DKK1基因的表达,DKK1基因对BMP4基因作用不明显,结果可为进一步研究其功能奠定基础。

主 题 词：同源重组 成纤维细胞 DKK1、BMP4质粒共转染 RT-PCR WesternBlot 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 

核心收录：

D　O　I：10.7668/hbnxb.2018.05.017

馆 藏 号：203391545...