家蝇几丁质酶MDCht9基因的克隆表达与酶活分析

作     者：李妍 马慧玲 苏佩佩 赵欣宇 赵文静 国果 Yan Li;Hulling Ma;Peipei Su;Xinyu Zhao;Wenjing Zhao;Guo Guo

作者机构：贵州医科大学基础医学院贵州贵阳550000 贵州医科大学环境污染与疾病监控教育部重点实验室贵州贵阳550000 

基　　金：国家自然科学基金项目("家蝇几丁质降解酶家族基因的表达特性及功能研究" No.81560337 "基于转录组挖掘的家蝇新抗菌肽(MD-APMs-17)的功能及其抗真菌机制研究" No.81760647) 

出 版 物：《生物技术》 (Biotechnology)

年 卷 期：2018年第28卷第5期

页      码：417-424页

摘      要：[目的]对MDCht9基因进行生物信息学分析,构建原核表达载体,获得重组蛋白,并测其酶学活性。[方法]构建邻位连接树研究MDCht9基因的分类归属及其与黑腹果蝇、冈比亚按蚊和致倦库蚊几丁质酶的进化关系,采用生物信息学软件,分析MDCht9基因及编码蛋白的理化性质,信号肽、二级结构等,预测蛋白质的功能;根据其c DNA序列设计引物,PCR扩增,以p ET28(+)为载体构建重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)进行诱导,表达产物用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,质谱鉴定纯化蛋白。几丁质酶活测定:以4MU-(Glc NAc)3为底物,测定重组蛋白的酶学活性。[结果]系统发育树表明MDCht9基因与果蝇Cht9基因同源性最高,其ORF全长1 401 bp,编码466个氨基酸,理论分子量为50 827. 2 Da,等电点为6. 97,属于亲水性蛋白。MDCht9基因编码蛋白的第1-22氨基酸为信号肽,剪切位点位于第22与第23位氨基酸之间。MDCht9蛋白的功能结构域位于第24-357位氨基酸间,是18家族几丁质糖基水解酶的催化域,第413-466位氨基酸之间的序列为几丁质结合区域。MDCht9蛋白的二级结构及三级结构显示有3种类型:以无规则卷曲为主(Cc),其次为α-螺旋(Hh)和β折叠(Ee)。构建了具有正确序列的MDCht9重组表达质粒,重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达;通过亲和层析柱纯化的重组蛋白质谱鉴定,与MDCht9序列一致,提示MDCht9重组蛋白获取成功。酶学活性表明不同浓度的MDCht 9重组蛋白均有几丁质酶活性,而且呈现一定的量效关系,0. 18 mg/m L重组蛋白的4 MU生成量为53. 63 U,0. 045 mg/m L重组蛋白的4 MU生成量为9. 97 U。[结论]采用原核表达系统成功获得MDCht9的重组蛋白,且重组蛋白有较强的酶活性,为进一步研究其功能奠定了基础。

主 题 词：家蝇 几丁质酶 生物信息学分析 基因克隆 表达 几丁质酶活性 

学科分类：1001[医学-基础医学] 100103[100103] 10[医学] 

D　O　I：10.16519/j.cnki.1004-311x.2018.05.0073

馆 藏 号：203394747...