版纳微型猪近交系TNF-α基因mRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立

作     者：霍金龙 李颖 赵跃 潘伟荣 刘丽仙 霍海龙 曾养志 HUO Jin-long;LI Ying;ZHAO Yue;PAN Wei-rong;LIU Li-xian;HUO Hai-long;ZENG Yang-zhi

作者机构：云南农业大学云南省版纳微型猪近交系重点实验室昆明650201 昆明医学院第二附属医院整形外科昆明650101 云南农业职业技术学院畜牧兽医系昆明650212 

基　　金：云南省应用基础研究计划面上项目(No.2010ZC241) 云南省教育厅科学研究基金(No.2010Y219) 

出 版 物：《中国实验动物学报》 (Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica)

年 卷 期：2011年第19卷第2期

页      码：153-160页

摘      要：目的快速、灵敏、可靠的检测与临床多种疾病密切相关的重要基因TNF-α的表达情况,构建TNF-α基因及内参GAPDH基因荧光定量PCR质粒标准品。方法利用版纳微型猪近交系4～6月龄猪建立动物模型,提取皮肤创面总RNA,设计特异引物,进行RT-PCR扩增。纯化目的片段与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,并经酶切、PCR和测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR,生成标准曲线。结果建立的TNF-α基因和GAPDH内参基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法灵敏度分别可达103和105拷贝,线性范围分别为103～109和105～109拷贝,阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在的线性关系R2分别为0.993和0.999,扩增效率E分别为111.073%和95.948%。结论成功的构建了版纳微型猪近交系TNF-α基因质粒标准品和标准曲线,并用内参基因GAPDH进行校正,此方法可为探讨TNF-α基因在临床多种疾病中所发挥的分子机理奠定基础。

主 题 词：版纳微型猪近交系 实时荧光定量 TNF-α基因 GAPDH基因 基因表达 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 071002[071002] 

核心收录：

D　O　I：10.3969/j.issn.1005-4847.2011.02.015

馆 藏 号：203395528...