Gibson Assembly系统构建双标签原核类泛素蛋白表达载体

作     者：张雨晴 刘毅 张旭霞 李传友 Zhang Yuqing, Liu Yi, Zhang Xuxia, Li Chuanyou

作者机构：首都医科大学附属北京胸科医院北京市结核病胸部肿瘤研究所耐药结核病重点实验室细菌免疫室101149 

基　　金：北京市医院管理局青苗计划(QML20161601) 首都卫生科研发展专项(2018-1-1041) 

出 版 物：《结核病与胸部肿瘤》 (Tuberculosis and Thoracic Tumor)

年 卷 期：2018年第3期

页      码：170-175页

摘      要：目的体外构建表达原核类泛索蛋白（prokaryotic ubiquitin-like protein，Pup）的载体是研究Pup化靶蛋白的重要基础，为了提高蛋白纯化的效能和特异性需要构建带组氨酸（his6）和链霉素（strep）标签的Pup蛋白表达载体，为后续研究Pup-蛋白酶体在分枝杆菌中的应激调控奠定基础。方法设计合成his6-strep片段，扩增富集***片段，从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增Pup片段；应用Gibson Assembly系统采用同源片段重组方法将his6-strep片段和PUP片段依次连接到载体上，构建带双标签的原核表达载体pET28a—his6-strep-Pup和大肠肝菌-结核杆菌穿梭质粒pMV261-his6-strep—Pup表达载体，经酶切和聚合酶链反应验证，分别导人大肠杆菌（***）和耻垢分枝杆菌（***）中，鉴定和测序获得正确单克隆菌株。培养富集菌株，超声破碎离心收集上清和沉淀，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）电泳，用免疫印迹法（Western blot）验证标签蛋白在***和***中的表达。结果经聚合酶链反应鉴定及测序，证实成功构建了双标签Pup表达载体并导人目的菌株，诱导后蛋白表达，Western blot结果表明标签蛋白在***和***中均可得到正确表达，在***中可发现多种靶蛋白被Pup化结合。结论快速高效地构建了表达***蛋白的双标签重组载体，可以应用于后续Pup的表达纯化及Pup化蛋白的功能分析，为进一步开展对Pup-蛋白酶体在分枝杆菌应激调控中的功能研究打下了良好的基础。

主 题 词：印迹法,蛋白质 GibsonAssembly 同源重组 标签蛋白 原核类泛素蛋白 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 071007[071007] 

馆 藏 号：203410391...