靶向TNF-α基因shRNA干扰片段的筛选和重组体的构建

作     者：宋晓宇 郑宁宁 孙鲁宁 张海鹏 SONG Xiao-Yu;ZHENG Ning-Ning;SUN Lu-Ning;ZHANG Hai-Peng

作者机构：中国医科大学基础医学院病理生理教研室辽宁沈阳110001 

基　　金：国家自然科学基金资助项目 编号39570778 

出 版 物：《中国实验血液学杂志》 (Journal of Experimental Hematology)

年 卷 期：2009年第17卷第1期

页      码：180-183页

摘      要：本研究利用RNA干扰技术,筛选出可以高效、特异性抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的小发夹状RNA(shRNA)片段,设计并构建重组质粒,进行序列分析,为探索TNF-α相关疾病的基因治疗提供新途径。取原代培养小鼠腹腔巨噬细胞,置于15%DMEM中,调细胞浓度为2×107/L,接种于6孔板,3ml/well;细胞用脂多糖(LPS)激活,ELISA法测不同时间培养上清中TNF-α的浓度;将针对TNF-α基因的5段shRNA干扰片段的表达框经PCR扩增、纯化后,与转染试剂混合转染入巨噬细胞,细胞用LPS激活24小时后用ELISA法测培养上清中TNF-α的浓度,RT-PCR法测细胞TNF-αmRNA的表达;将最有效抑制TNF-α表达的干扰片段插入质粒载体,转化***5α感受态菌株,提取质粒,进行测序分析。结果表明:LPS刺激巨噬细胞24小时后,细胞分泌TNF-α达高峰;转染了干扰序列1的细胞培养上清中TNF-α浓度与对照组相比下降最明显(p<0.05),达59.46%,TNF-αmRNA的表达被抑制了61.2%;将干扰序列1DNA序列克隆到载体上,经测序鉴定确实为所需序列。结论:成功筛选出靶向TNF-α基因的shRNA干扰片段并构建重组质粒,可进一步利用克隆所得到的shRNA干扰TNF-αmRNA的表达,为TNF-α相关疾病的基因治疗提供新手段。

主 题 词：肿瘤坏死因子-α 小发夹状RNA RNA干扰 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 

馆 藏 号：203419520...