人端粒酶逆转录酶基因siRNA质粒的构建及其对不同p53状态卵巢癌细胞生长和凋亡的影响

作     者：罗祎 姚珍薇 杨雅莹 易永芬 

作者机构：重庆医科大学附属第一医院妇产科重庆400016 重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心病理学教研室重庆400016 

出 版 物：《中国生物制品学杂志》 (Chinese Journal of Biologicals)

年 卷 期：2013年第26卷第6期

页      码：780-786,791页

摘      要：目的构建人端粒酶逆转录酶(Human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因小干扰RNA(Small interferingRNA,siRNA)质粒,并探讨其对不同p53状态卵巢癌细胞SKOV3(缺p53)和OVCAR3(含p53)生长和凋亡的影响。方法设计并合成针对hTERT基因的siRNA,与表达的质粒pGenesil-1连接,构建重组表达质粒pG1、pG2和pGCR(阴性对照质粒),分别转染卵巢癌细胞SKOV3和OVCAR3,并设未转染细胞对照组和转染空载体对照组。转染后48 h,荧光显微镜观察并计算转染效率;实时荧光定量PCR法检测转染细胞中hTERT基因mRNA的表达;Western blot检测转染细胞中hTERT、p53和p21蛋白的表达;端粒重复序列扩增(Telomeric repeat amplification portocol,TRAP)法检测转染细胞端粒酶的活性;CCK-8法检测细胞生长情况;流式细胞仪和AnnexinⅤ-PE/7-AAD双染法分别检测细胞周期和细胞凋亡的情况。结果已成功构建了靶向hTERT siRNA重组质粒pG1、pG2和阴性对照质粒pGCR,具有较高的转染效率,与pGCR转染组相比,pG1和pG2转染组hTERT基因和蛋白表达(P<0.05)及端粒酶活性均明显降低,pG1和pG2转染组均可抑制两种细胞的生长,且对OVCAR3细胞的抑制作用强于SKOV3细胞;pG1和pG2转染组G0-G1期细胞比例明显下降,S期细胞比例明显增多(P<0.05);在OVCAR3细胞中,hTERT表达受抑后均出现了明显的凋亡,同时伴随p53和p21蛋白表达的增加,在缺乏p53基因的SKOV3细胞中并未导致明显的凋亡,其p21蛋白表达明显低于pGCR转染组(P<0.05)。结论构建的靶向hTERT siRNA重组表达质粒在体外能有效和特异地沉默卵巢癌细胞hTERT基因的表达,降低端粒酶活性,并引起肿瘤细胞的生长抑制和凋亡,其机制可能与抑癌基因p53及p21上调有关。

主 题 词：人端粒酶逆转录酶 RNA干扰 卵巢癌 细胞增殖 细胞凋亡 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 1002[医学-临床医学类] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 100214[100214] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 10[医学] 

D　O　I：10.13200/j.cjb.2013.06.41.luoy.025

馆 藏 号：203442825...