人胚胎干细胞无血清无饲养层培养体系的建立

作     者：胡智兴 吴兰鸥 郑春兰 周轶平 罗敏 梁道明 Hu Zhi-xing;Wu La-nou;Zheng Chun-lan;Zhou Yi-ping;Luo Min;Liang Dao-ming

作者机构：昆明医学院药理学教研室云南省昆明市650031 昆明医学院云南省天然药物药理重点实验室云南省昆明市650031 昆明医学院第二附属医院云南省昆明市650031 

基　　金：云南省科技厅-昆明医学院应用基础研究联合专项基金(2007C0012R 2007C0044R) 

出 版 物：《中国组织工程研究与临床康复》 (Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research)

年 卷 期：2009年第13卷第45期

页      码：8889-8894页

摘      要：背景:研究表明FGF2,TGFβ/activin/nodal和IGF信号通路是人胚胎干细胞保持其多能性所必需的,然而直接添加外源性碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β和胰岛素是否能够维持人胚胎干细胞的自我更新目前尚无报道。目的:拟建立人胚胎干细胞无饲养层无血清条件下的培养体系。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-09/2009-02在中国科学院昆明动物研究所完成。材料:12.5～13.5d龄清洁级ICR孕鼠2只,由昆明医学院动物中心提供。人胚胎干细胞株BG02购自美国Bresagen公司。方法:①消化离心BG02细胞,重悬于无饲养层过渡培养基后接种,常规培养5～7d,挑去分化的人胚胎干细胞,加入分散酶消化,切割成小团块,离心重悬后按1∶3比例重新接种预铺层粘连蛋白的4孔板,此时培养基换成无血清无饲养层培养基,由80%DMEM/F12、20%KSR、2mmol/Lglutamine、1%非必需氨基酸、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、ITS(×1)、106U/L青霉素、100mg/L链霉素、4μg/L碱性成纤维细胞生长因子、0.12μg/L转化生长因子β1组成。②无菌条件下取出ICR胎鼠,组织块胰酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,接种在0.1%明胶包被的6孔板中即为饲养层。将生长在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细胞株BG02预铺至有层粘连蛋白的培养板上,加入含碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1及ITS的无血清培养基连续培养。主要观察指标:观察BG02细胞在无血清无饲养层培养体系中的形态,采用细胞免疫组化法检测人胚胎干细胞特异性分子标志的表达,检测BG02细胞体外分化能力及其核型,比较BG02细胞在无血清无饲养层和小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系中的生长情况、细胞集落分化率。结果:在无血清无饲养层培养体系中,BG02细胞连续传代20代,细胞呈典型的人胚胎干细胞形态特征;BG02细胞表达SSEA-4,SSEA-3,TRA-1-60,TRA-1-81,Oct-4,但不表达SSEA-1;培养20d后,BG02细胞进一步分化成3个胚层的细胞,分化细胞能够表达甲胎蛋白、巢蛋白、α-肌动蛋白;培养至20代细胞核型均正常(46XY)。与在饲养层培养体系下比较,无血清无饲养层条件下BG02细胞BG02细胞生长速度减慢,细胞倍增时间明显延长(P<0.05),集落分化率明显升高(P<0.05)。结论:实验初步建立了人胚胎干细胞无血清无饲养层的培养体系,添加碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1和ITS可以维持人胚胎干细胞的自我更新。

主 题 词：人胚胎干细胞 无血清 无饲养层 培养 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 071007[071007] 

D　O　I：10.3969/j.issn.1673-8225.2009.45.016

馆 藏 号：203450079...