鸭胚成纤维细胞上坦布苏病毒受体蛋白的鉴定

作     者：赵冬敏 韩凯凯 刘青涛 黄欣梅 杨婧 刘宇卓 章丽娇 田宇杰 王梦瑶 李银 ZHAO Dong-min;HAN Kai-kai;LIU Qing-tao;HUANG Xin-mei;YANG Jing;LIU Yu-zhuo;ZHANG Li-jiao;TIAN Yu-jie;WANG Meng-yao;LI Yin

作者机构：江苏省农业科学院兽医研究所/国家兽用生物制品工程技术研究中心/农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室南京210014 

基　　金：国家重点研发计划项目(2017YFD0500804) 江苏省自然科学基金优秀青年基金项目(BK20160064) 

出 版 物：《南方农业学报》 (Journal of Southern Agriculture)

年 卷 期：2019年第50卷第1期

页      码：173-178页

摘      要：【目的】拓展对坦布苏病毒受体的认知,为研究其在鸭体内的感染机制打下基础。【方法】取9日龄SPF鸭胚制备鸭胚成纤维细胞(DEF),待细胞长成单层后提取DEF膜蛋白,利用免疫共沉淀试验筛选出DEF膜蛋白中可与坦布苏病毒结合的蛋白,经病毒辅覆蛋白结合分析(VOPBA)验证后通过LC-MSMS质谱分析进行鉴定;同时人工合成鸭热休克蛋白70基因(HSP70)序列的开放阅读框(1905 bp),构建重组质粒pET32a-HSP70并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,以重组蛋白免疫小鼠制备抗鸭HSP70血清,与DEF细胞共孵育后接种坦布苏病毒,并采用实时荧光定量PCR检测抗血清对病毒感染的抑制作用。【结果】DEF膜蛋白中分子量约70 kD的蛋白可与坦布苏病毒结合,经LC-MSMS质谱分析和序列比对可确定该蛋白即为鸭热休克蛋白70(HSP70)。含重组质粒pET32aHSP70的BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导4 h后,SDS-PAGE检测发现在分子量约85 kD处出现目的蛋白条带,获得的重组鸭HSP70蛋白主要以包涵体形式进行表达,且能与His标签抗体发生特异性反应。以重组鸭HSP70蛋白免疫小鼠获得的抗鸭HSP70血清可封闭DEF细胞上的HSP70,而竞争性抑制坦布苏病毒感染。【结论】HSP70是坦布苏病毒感染DEF细胞的受体,可作为新的靶点用于抗坦布苏病毒药物设计。

主 题 词：坦布苏病毒 鸭胚成纤维细胞 热休克蛋白70 受体 免疫共沉淀 病毒辅覆蛋白结合分析(VOPBA) 

学科分类：090601[090601] 09[农学] 0906[农学-水产类] 

D　O　I：10.3969/j.issn.2095-1191.2019.01.25

馆 藏 号：203459322...