针对Toll样受体4基因的小发夹结构RNA对RAW264·7细胞炎症因子分泌的抑制作用

作     者：张进祥 王慧 吴河水 蒋春舫 郑启昌 ZHANG Jin-xiang;WANG Hui;WU He-shui;JIANG Chun-fang;ZHENG Qi-chang

作者机构：华中科技大学附属协和医院急诊外科武汉430022 华中科技大学同济医学院医学生物学系 

基　　金：国家自然科学基金资助项目(30200272) 

出 版 物：《中华医学杂志》 (National Medical Journal of China)

年 卷 期：2006年第86卷第19期

页      码：1323-1326页

摘      要：目的构建针对Toll样受体(TLR)4mRNA的小发夹结构RNA(shRNA)真核表达载体pEGFP-siRNA/TLR4,检测该shRNA诱导的RNA干扰(RNAi)对脂多糖刺激RAW264·7细胞分泌炎症因子的抑制作用,以探讨针对TLR4基因的RNAi对RAW264·7细胞炎症反应的抑制作用。方法构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)及shRNA克隆位点的质粒pEGFP-H1/siRNA,运用网络工具siRNAWizard(http://www·sirnawizard·com/)设计针对TLR4mRNA的寡核苷酸片段。将其克隆入pEGFP-H1/siRNA,构建表达EGFP及TLR4-shRNA的真核表达质粒pEGFP-H1/TLR4-siRNA。运用脂质体转染技术将pEGFP-H1/TLR4-siRNA转染至培养的小鼠巨噬细胞系RAW264·7,观察细胞系中荧光蛋白的表达强度;再运用脂多糖刺激转染的RAW264·7细胞,运用ELISA方法检测该细胞系分泌炎症因子水平的变化。结果质粒pEGFP-H1/siRNA及pEGFP-H1/TLR4-siRNA分别用BbsⅠ和MluⅠ酶切电泳后,前者出现4·9kb和340bp的的条带,后者出现5·0kb和220bp的条带,与实验设计的质粒长度一致,且测序证实克隆序列正确。将pEGFP-H1/TLR4-siRNA转染至RAW264·7细胞后,EGFP的表达率为50%±8%。用脂多糖刺激后,TLR4-SiRNA转染组细胞培养液TNF-α水平(2h:825pg/ml±136pg/ml;8h:2190pg/ml±359pg/ml)明显低于对照siRNA转染组(2h:1179pg/ml±240pg/ml;8h:4720pg/ml±227pg/ml,均P<0·01)。结论针对TLR4mRNA的shRNA可能通过RNAi机制对脂多糖诱导的RAW264·7细胞炎症因子的分泌有明显的抑制作用。

主 题 词：RNA 基因沉默 脂多糖类 巨噬细胞 

学科分类：1001[医学-基础医学] 100104[100104] 10[医学] 

核心收录：

D　O　I：10.3760/j:issn:0376-2491.2006.19.007

馆 藏 号：203470688...