黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

作     者：童星 唐秋嵩 吴玉飞 吴敬 陈坚 

作者机构：江南大学食品科学与技术国家重点实验室无锡214122 江南大学工业生物技术教育部重点实验室无锡214122 江南大学环境与土木工程学院无锡214122 

基　　金：国家杰出青年基金(20625619) 食品科学与技术国家重点实验室科研基金(SKLF-MB-200802) 国家"973项目"(2007CB714036)~~ 

出 版 物：《微生物学报》 (Acta Microbiologica Sinica)

年 卷 期：2009年第49卷第2期

页      码：262-268页

摘      要：【目的】以毕赤酵母(Pichia pastoris)KM71为宿主菌表达黑曲霉(Aspergillus niger)SG136 α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)。【方法】以实验室保藏的*** SG136总DNA为模板,根据NCBI数据库中*** CBS 513.88 α-葡萄糖苷酶的cDNA序列(aglu)设计引物,通过PCR和重叠延伸PCR(overlap-PCR)方法,扩增得到aglu,将其克隆到载体pMD18-T simple vector,测序结果表明,aglu编码960个氨基酸。与*** CBS 513.88α-葡萄糖苷酶相比仅有一个氨基酸的差异。将得到的aglu亚克隆到质粒pPIC9K,构建表达载体pPIC9K-aglu,经BglⅡ线性化后电转化*** KM71,经过MD、YPD/G418平板筛选表型,PCR方法验证,获得分泌表达重组*** KM71/pPIC9K-aglu。摇瓶培养中通过添加终浓度为1%的甲醇诱导α-葡萄糖苷酶的分泌。【结果】SDS-PAGE显示表达蛋白的大小亚基分子量分别为98kDa和33kDa,阴性对照中没有出现此条带,非变性电泳检验为一条带。制备的粗酶液的酶学性质表明,转苷反应最适pH为5,最适温度为55℃。在最适pH和温度下,反应24h时低聚异麦芽糖的总含量达到最大为26.0%。【结论】黑曲霉α-葡萄糖苷酶在***中获得可溶性表达,并证明有一定的转糖苷活性。

主 题 词：黑曲霉 α-葡萄糖苷酶 克隆 overlap-PCR 毕赤酵母 表达 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 1002[医学-临床医学类] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 

核心收录：

D　O　I：10.13343/j.cnki.wsxb.2009.02.008

馆 藏 号：203496155...