MIR-122慢病毒表达载体构建及稳定转染HepG2细胞系

作     者：张旭 于芳 聂勇战 唐红卫 梁琳琳 陈蕊蕊 ZHANG Xu;YU Fang;NIE Yong-zhan;TANG Hong-wei;LIANG Lin-lin;CHEN Rui-rui

作者机构：第四军医大学西京消化病医院肿瘤生物学国家重点实验室陕西西安710032 

基　　金：国家自然科学基金项目(30770959) 

出 版 物：《现代生物医学进展》 (Progress in Modern Biomedicine)

年 卷 期：2012年第12卷第10期

页      码：1849-1852页

摘      要：目的:构建人mir-122慢病毒表达载体,感染肝癌细胞HepG2,建立稳定表达mir-122的HepG2细胞系。方法:以人has-mir-122成熟序列,设计并合成引物,采用PCR的方法扩增目的基因,并连接到慢病毒表达质粒pGCSIL-GFP(含绿色荧光蛋白GFP基因)中。对重组质粒进行双酶切鉴定后,进行mir-122基因慢病毒(pGCSIL-GFP-miR-122)的包装及病毒滴度测定,用构建好的慢病毒表达载体感染HepG2细胞,qPCR检测感染后细胞中MIR-122的变化。通过流式细胞仪检测荧光蛋白GFP,westernblot检测mir-122靶分子CAT-1,验证pGCSIL-GFP-miR-122在HepG2细胞中的表达效果。结果:pGCSIL-GFP-miR-122经双酶切分析及测序,插入序列正确。qPCR检测显示转入病毒后mir-122在细胞中的表达显著提高。表明mir-122慢病毒表达载体构建成功。流式细胞仪根据GFP荧光筛选纯化感染后细胞,感染率达90%以上。Western blot显示mir-122明显抑制其靶分子表达。进一步验证pGCSIL-GFP-miR-122在细胞中的稳定表达。结论:成功构建mir-122慢病毒表达载体,并建立稳定表达的细胞系,为研究mir-122在人体所起的作用及功能机制打下基础。

主 题 词：microRNA mir-122 慢病毒表达载体 稳定转染 HepG2细胞 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 

D　O　I：10.13241/j.cnki.pmb.2012.10.049

馆 藏 号：203534560...