H7N9禽流感病毒重组质粒构建及应用

作     者：张锦海 陈文琦 胡丹 王平 吕恒 刘玉 陈凤娟 任浩 王长军 

作者机构：南京军区军事医学研究所江苏南京210002 南京医科大学附属南京医院 第二军医大学热带医学与公共卫生学系 

基　　金：国家重大传染病防治专项(2013ZX10004-103 2013ZX10004-203 2013ZX10004-218 2012ZX10004801-004) 全军后勤科研"十二五"重大项目(AWS11C001 AWS11C009) 南京军区医学科技重点课题(10Z039 11Z040) 第二军医大学军事医学专项(2012JS01) 江苏省科技支撑计划(社会发展)项目(BE2012609 BE2013603) 

出 版 物：《中国公共卫生》 (Chinese Journal of Public Health)

年 卷 期：2013年第29卷第12期

页      码：1868-1870页

摘      要：目的构建一种含H7N9禽流感病毒全长血凝素/神经氨酸酶/基质蛋白(HA/NA/M)基因的重组质粒,为核酸检测方法提供一种通用的阳性定量标准品。方法设计H7N9禽流感病毒HA、NA及M抗原基因全长开放阅读框的克隆引物,提取H7N9禽流感病毒总RNA后用实时荧光定量PCR获得相应片段,用3次酶切连接方法,依次插入到pGEM-T easy质粒,进行测序确认;线性化后的重组质粒用T7 RNA聚合酶进行体外转录,RNA转录产物纯化后测定浓度,用实时荧光定量PCR构建标准曲线进行验证。结果 HA、NA和M基因扩增片段大小分别约为1.7、1.3、1.1 kb,与预期相符;构建的重组质粒pGEM-HA-NA-M插入片段的测序结果与GenBank公布序列一致;由重组质粒体外转录获得同时含有H7N9禽流感病毒HA、NA、M全长开放阅读框序列的RNA片段质量浓度为399.5 ng/μL,梯度稀释后用3种实时荧光定量PCR方法均获得了良好的标准曲线。结论成功构建重组质粒pGEM-HA-NA-M,由此质粒体外转录获得的RNA片段可作为H7N9禽流感病毒核酸快速检测方法通用的阳性定量标准品。

主 题 词：H7N9禽流感病毒 血凝素 神经氨酸酶 基质蛋白 标准品 

学科分类：1004[医学-公共卫生预防医学类] 100401[100401] 10[医学] 

D　O　I：10.11847/zgggws2013-29-12-50

馆 藏 号：203558208...