热休克蛋白47(HSP47)-短发夹RNA的构建及其细胞水平对HSP47表达的影响

作     者：范翔雪 陶然 黄加权 邓菊红 李兰 马科 徐蕾 宁琴 

作者机构：华中科技大学同济医学院附属同济医院感染科武汉430030 华中科技大学同济医学院附属梨园医院内科武汉430077 

基　　金：湖北省血吸虫病防治项目(No.XF2010-15 XF2012-17) 百洋肝纤维化基金资助(No.2010-009) 

出 版 物：《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 (Chinese Journal of Parasitology and Parasitic Diseases)

年 卷 期：2014年第32卷第4期

页      码：258-263页

摘      要：目的针对肝纤维化发病关键基因热休克蛋白47(HSP47)基因构建HSP47-shRNA,初步验证其在NIH/3T3细胞系干预HSP47基因的表达,影响HSP47 mRNA及蛋白水平表达,并观察该细胞功能学变化。方法设计HSP47-shRNA模板,并将其分别设计于U6启动子的下游引物,将U6启动子及其下游HSP47-shRNA的模板双链DNA连接入载体,构建HSP47-pGCsi-U6-shRNA重组质粒(HSP47-1-pGCsi-U6-shRNA、HSP47-2-pGCsi-U6-shRNA和HSP47-3-pGCsi-U6-shRNA)。以非相关干扰质粒作为对照,通过脂质体介导转染HSP47-shRNA至小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)中,分别于12、24、48和72h在倒置荧光显微镜下观察细胞转染效率和荧光表达强度;同时于转染后0、24和48h收集细胞,采用RT-PCR和蛋白质印迹(Western blotting)分析HSP47 mRNA和蛋白表达情况;并观察干预后该细胞分泌胶原功能和小鼠转化生长因子(TGF-β1)表达的变化。结果成功构建HSP47-shRNA载体,通过脂质体介导转染入NIH/3T3细胞,各干扰质粒转染效率均约为60.0%,各干扰质粒转染效率间差异无统计学意义(P>0.05)。转染12 h,可见少量绿色荧光细胞,随转染时间的延长,细胞荧光表达量逐渐增加,各干扰质粒于转染72h荧光表达最强。shRNA干扰显著抑制HSP47蛋白的表达,以转染HSP47-1-shRNA 24h后对蛋白表达抑制效果最佳,对HSP47 mRNA的相对沉默效率为(25.83±1.79)%,与空白组及非相关对照组比较,差异有统计学意义(P0.05)。各组HSP47-shRNA干扰质粒对TGF-β1 mRNA的抑制效率以转染24 h效果最佳,相对表达分别为(63.23±2.18)%、(64.53±3.17)%和(75.19±4.20)%,均低于空白组和非相关对照组(P0.05)。各HSP47-shRNA干扰质粒组细胞上清中TGF-β1的抑制率以转染24h为最佳,分别为(51.79±3.12)%、(66.67±2.13)%和(69.61±3.65)%,与空白组相比,HSP47-1-shRNA组与HSP47-2-shRNA组对TGF-β1均有显著抑制作用,且以HSP47-1-shRNA组抑制效率更佳(P0.05)。结论构建了HSP47-shRNA干扰质粒,初步证实其对HSP47的表达干预有效,并引起NIH/3T3细胞功能学的变化。

主 题 词：热休克蛋白47 RNA干扰 shRNA NIH 3T3细胞 I III型胶原 转染 

学科分类：1001[医学-基础医学] 100103[100103] 10[医学] 

核心收录：

馆 藏 号：203566451...