新型骨形态发生蛋白2反转录病毒载体的构建及活性检测

作     者：廖青 唐颖 赤仁杰 陈晓春 关景玉 段有文 Liao Qing;Tang Ying;Chi Ren-jie;Chen Xiao-chun;Guan Jing-yu;Duan You-wen

作者机构：大庆油田总医院黑龙江省大庆市163001 大庆龙南医院黑龙江省大庆市163301 沈阳医学院附属奉天医院辽宁省沈阳市110024 

出 版 物：《中国组织工程研究与临床康复》 (Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research)

年 卷 期：2010年第14卷第7期

页      码：1227-1230页

摘      要：背景:骨形态发生蛋白是一种具有潜在活性的蛋白质,当骨组织损伤时其迅速增加并活性的增强,与载体复合能修复动物骨缺损,但将其用做基因治疗的研究未见报道。目的:构建表达重组人骨形态发生蛋白2基因的重组反转录病毒载体,探讨其在成骨细胞中的生物学作用。方法:根据Genbank中人骨形态发生蛋白2基因序列设计并合成骨形态发生蛋白2特异性引物,高保真PCR扩增骨形态发生蛋白2基因,同源重组法将骨形态发生蛋白2PCR片段连接与克隆载体pDNR-CMV,构成pDNR-CMV-BMP2,经酶切、PCR和测序鉴定后,将重组质粒pDNR-CMV-BMP2和反转录病毒空质粒pLP-LNCX以loxP位点进行同源重组,构成反转录病毒载体pLP-LNCX-BMP2,转染入包装细胞PT67进行病毒包装,并用NIH3T3细胞进行病毒滴度测定;将反转录病毒感染人成骨细胞,四甲基偶氮唑盐法检测细胞生长变化,转染48h后Westernblotting检测骨形态发生蛋白2蛋白表达。结果与结论:pDNR-CMV-BMP2质粒SalI和EcoRI双酶切、PCR及测序结果均正确,重组质粒pLP-LNCX-BMP2经氯霉素及蔗糖筛选得到的阳性克隆骨形态发生蛋白2PCR结果阳性,酶切产物与预期相一致;病毒载体pLP-LNCX-BMP2转染PT67后,G418筛选可得到稳定细胞克隆,其上清液中病毒滴度可达到5×108pfu;四甲基偶氮唑盐检测中反转录病毒组与正常对照组相比,72h细胞抑制率无明显差别(P>0.05),转染48h后Westernblotting可见骨形态发生蛋白2蛋白高表达。结果说明,实验成功克隆了骨形态发生蛋白2基因并构建其反转录病毒表达载体。

主 题 词：骨形态发生蛋白2基因 反转录病毒 成骨细胞 四甲基偶氮唑盐 蛋白表达 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 0831[工学-公安技术类] 1007[医学-药学类] 0403[0403] 1002[医学-临床医学类] 08[工学] 1010[医学-医学技术类] 0703[理学-化学类] 0836[0836] 

D　O　I：10.3969/j.issn.1673-8225.2010.07.020

馆 藏 号：203579685...