人重型肝炎相关基因Fas、TNFR1真核表达载体和microRNA表达载体的构建及其体外干预效应的初步研究

作     者：高随 习东 郭健文 严伟明 罗小平 宁琴 

作者机构：华中科技大学同济医学院附属同济医院1感染科2儿科武汉430030 

基　　金：国家“973计划”重要传染病基础研究重大项目(No.2005CB522901,No.2007CB512900) 国家自然科学基金青年基金资助项目(No.NSFC30700702) 

出 版 物：《华中科技大学学报（医学版）》 (Acta Medicinae Universitatis Scientiae et Technologiae Huazhong)

年 卷 期：2010年第39卷第1期

页      码：50-54页

摘      要：目的构建人Fas(hFas)和人TNFR1(hTNFR1)基因的真核表达质粒pcDNA3.0-hFas、pcDNA3.0-hTN-FR1和microRNA(miRNA)干扰质粒p-hFasmiRNA、p-hTNFR1miRNA,初步验证其在体外细胞系对Fas和TNFR1基因表达的干预效应。方法从人肝癌细胞HepG2细胞中获得模板cDNA,通过PCR扩增出hFas和hTNFR1全长片段,将目的片段通过T载体过渡克隆至表达载体pcDNA3.0,得到重组质粒pcDNA3.0-hFas和pcDNA3.0-hTNFR1。利用miRNA设计软件,针对Fas和TNFR1基因分别设计3对pre-microRNA(pre-miRNA)序列,通过T4连接酶将pre-miRNA克隆至pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA表达载体,同时构建非相关干扰质粒。构建成功的p-hFasmiRNA1、p-hFasmiRNA2、p-hFasmiRNA3和p-hTNFR1miRNA1、p-hTNFR1miRNA2、p-hTNFR1miRNA3分别与pcDNA3.0-hFas和pcDNA3.0-hTNFR1共转染至人293T细胞,通过Real-time PCR和Western blot检测转染48 h后对基因表达的干预效应。结果通过测序鉴定表明Fas和TNFR1基因的真核表达载体和miRNA干扰质粒均构建成功。Real-time PCR结果显示干预组的Fas和TNFR1基因的表达与对照组比较明显减少,抑制效率分别可达到87%和80%。Western blot结果也同样证实干预组的Fas和TNFR1基因的蛋白表达量与对照组比较明显减少。结论成功构建了hFas和hTN-FR1的真核表达载体和microRNA干扰质粒,并初步证实构建的microRNA干扰质粒在细胞水平对hFas和hTNFR1的表达具有特异性的抑制效应。

主 题 词：Fas TNFR1 microRNA 细胞凋亡 重型肝炎 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100201[100201] 10[医学] 

核心收录：

馆 藏 号：203594989...