利用CRISPR/Cas9技术对miRNA-125a进行基因编辑的实验研究

作     者：王瑚 张璐 马旭 夏红飞 Wang Hu;Zhang Lu;Ma Xu;Xia Hongfei

作者机构：国家卫生计生委科学技术研究所遗传优生中心北京100081 北京协和医学院研究生院北京100730 

基　　金：国家自然科学基金(批准号:81771590)资助的课题 

出 版 物：《中国细胞生物学学报》 (Chinese Journal of Cell Biology)

年 卷 期：2019年第41卷第2期

页      码：218-227页

摘      要：近年来, CRISPR/Cas9技术被迅速应用于生物学研究的各个领域。miRNA-125a已被证实与生殖密切相关,研究者在自然流产的患者中发现了异常的miRNA-125a。该研究利用CRISPR/Cas9技术在人绒毛膜滋养层细胞HTR8-S/Vneo中对miRNA-125a进行了定点编辑。对于定点敲除,我们首先在pX458表达载体的基础上额外引入一组启动子和sgRNA骨架序列用于片段敲除,此后分别设计用于单点敲除和片段敲除的sgRNA进行表达载体的构建,表达载体转染HTR8细胞后通过流式分选和T7EI酶切鉴定阳性单克隆;对于定点敲入,我们在体外构建供体载体,与CRISPR表达载体共转染HTR8细胞,通过流式分选和PCR鉴定阳性单克隆。DNA测序结果显示,敲除及敲入阳性单克隆细胞系在指定区域的碱基序列发生了改变; RT-qPCR结果显示,阳性单克隆细胞系中mi RNA-125a-5p和mi RNA-125a-3p的表达量较野生型也发生了相应变化;体外实验还显示, miRNA-125a有抑制HTR8-S/Vneo细胞系增殖及迁移的功能。研究证实, CRISPR/Cas9技术在细胞系中编辑mi RNAs是有效可行的,且对于miRNA-125a的定点敲除,片段敲除的效果要好于单点敲除。

主 题 词：CRISPR/Cas9 miRNA-125a 人绒毛膜滋养层细胞 片段敲除 定点敲入 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 

核心收录：

D　O　I：10.11844/cjcb.2019.02.0006

馆 藏 号：203607142...