靶向C区的小发卡RNA体外对耐药乙型肝炎病毒的抑制作用

作     者：任广立 方颖 马恒颢 张卫云 王鲜艳 许蔓春 罗爱武 赵树进 白雪帆 REN Guang-li;FANG Ying;MA Heng-hao;ZHANG Wei-yun;WANG Xian-yan;XU Man-chun;LUO Ai-wu;ZHAO Shu-jin;BAI Xue-jan

作者机构：广州军区总医院儿科广州510010 华南理工大学生物科学与工程学院广州510640 广州医学院附属口腔医院修复科广州510140 广州军区总医院检验科广州510010 广州军区总医院药剂科广州510010 第四军医大学唐都医院全军感染病中心西安710038 

基　　金：广东省自然科学基金(8451001002000762) 国家博士后基金(20100470917 201003353) 

出 版 物：《实用儿科临床杂志》 (Journal of Applied Clinical Pediatrics)

年 卷 期：2011年第26卷第22期

页      码：1706-1708,1715页

摘      要：目的评价基于载体的靶向乙型肝炎病毒(HBV)C基因的小发卡RNA(shRNA)对耐拉米夫定HBV的抑制作用,探讨新的抗病毒治疗手段。方法从临床耐拉米夫定患儿中提取耐药HBV基因组,经高保真重复延伸及序列拼接后测序,纯化并克隆到pGEM-T Easy TA载体,再经酶切消化,连接入pcDNA3.1载体,构建表达耐药HBV的表达载体pcDNA-HBV-1;根据GenBank收录HepG2细胞系中HBV基因全序列,设计构建针对HBV C基因区的3条siRNA的表达载体pSilencer4.1/HBV-C1,C2,C3。经退火连接入pSilencer-CMV4.1载体。中量超纯提取质粒,定量后与转染试剂siPort XP-1及pcDNA-HBV-1共转染人肝癌细胞系HepG2细胞。分别设立正常HepG2组(未转染组)、载体阴性对照组及共转染组。在共转染后的不同时间点,应用Western blot检测细胞中乙肝病毒表面抗原(HBsAg)蛋白、乙肝病毒e抗原(HBeAg)蛋白的表达;应用实时荧光定量PCR定量检测细胞上清中HBV DNA拷贝的变化。结果构建的耐药HBV表达载体用于转染HepG2细胞,在转染后的第7天至下次传代前该细胞中可检测到稳定表达的HBV DNA,HBsAg、HBeAg可检出。Western blot结果:在转染的第3天载体pSilencer4.1/HBV-C1、pSilencer4.1/HBV-C2、pSilencer4.1/HBV-C3均可抑制HBV的复制与表达,其中pSilencer4.1/HBV-C2抑制效应尤其显著,在转染后第3天对HBsAg、HBeAg的抑制率分别为(83.53±0.48)%、(86.12±0.83)%。定量PCR检测显示特异性siRNA可以显著抑制HBV-DNA,可以使DNA拷贝数降低102个数量级。结论基于载体的特异性siRNA在体外可抑制HepG2细胞中耐药HBV的复制和表达。该特异性siRNA可作为耐拉米夫定HBV的一种有效的基因治疗措施。

主 题 词：乙型肝炎病毒 小干扰RNA 基因治疗 耐药 HepG2细胞 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100202[100202] 10[医学] 

D　O　I：10.3969/j.issn.1003-515X.2011.22.006

馆 藏 号：203611296...