牛传染性鼻气管炎病毒内标荧光定量PCR检测方法的建立与应用

作     者：季新成 牛国辉 员丽娟 张彦明 李鹏 段晓东 于学辉 JI Xin-cheng;NIU Guo-hui;YUN Li-juan;ZHANG Yan-ming;LI Peng;DUAN Xiao-dong;YU Xue-hui

作者机构：西北农林科技大学陕西杨凌712100 新疆出入境检验检疫局新疆乌鲁木齐83006 新疆大学新疆乌鲁木齐830000 

基　　金：国家质量监督检验检疫总局资助项目(2007IK023) 

出 版 物：《中国兽医学报》 (Chinese Journal of Veterinary Science)

年 卷 期：2010年第30卷第6期

页      码：738-743,747页

摘      要：根据牛疱疹病毒1型(BHV1)gB基因序列,设计高度保守的引物和荧光探针,并扩增包含有荧光PCR扩增区域的核酸片段,通过凝胶纯化回收,将该片段克隆至pMD18-T载体,经鉴定后获得目标模板。通过碱基重排和引物设计,用搭桥法PCR扩增,获得BHV1荧光定量PCR内标模板。对内标模板的添加量和反应条件进行优化,建立了含有内标物的荧光定量PCR检测体系。该体系可以检测到10个拷贝/PCR反应的重组质粒,对BHV1可检测到0.01TCID50的病毒粒子,灵敏度比常规PCR和病毒分离高10～100倍,与不加内标的荧光PCR检测灵敏度相当。更重要的是,内标模板可以对反应体系进行监测,指示并校正假阴性结果,从而达到提高PCR检测准确率的目的。对临床收集的40份牛精液(其中8份已经鉴定为阳性)和10份牛鼻腔拭子(其中2份已经鉴定为阳性)用该体系进行检测,均得到预期结果。该方法的建立可用来对临床样品中BHV1的快速检测和实验室的质量控制。

主 题 词：牛传染性鼻气管炎病毒 荧光定量PCR 内标 共扩增 

学科分类：090601[090601] 09[农学] 0906[农学-水产类] 

核心收录：

D　O　I：10.16303/j.cnki.1005-4545.2010.06.009

馆 藏 号：203620047...