COL1A1-shRNA表达质粒构建及抑制COL1A1表达的有效序列的筛选

作     者：芦军 赵金满 孟艳 余永红 Jun Lu;Jin-Man Zhao;Yan Meng;Yong-Hong Yu

作者机构：中国医科大学第一附属医院消化内科辽宁省沈阳市110001 

基　　金：辽宁省教育厅高等学校科学技术基金资助项目 No.05L452 

出 版 物：《世界华人消化杂志》 (World Chinese Journal of Digestology)

年 卷 期：2008年第16卷第15期

页      码：1622-1627页

摘      要：目的:构建和筛选对大鼠肝星状细胞前Ⅰ型胶原α1链(COL1A1)mRNA有抑制作用的COL1A1短发夹RNA(shRNA)的表达质粒.方法:从NCBI网站获得大鼠的COL1A1cDNA序列,根据Whitehead研究所的siRNA设计软件设计3条理论上最佳的siRNA序列,相应的双链DNA被插入pGPU6/GFP/Neo质粒中,即pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C.为得到高效沉默COL1A1-siRNA,以脂质体LipofectAMINE2000,将1、2、3、4μgDNA质粒转染至HSC-T6细胞中,并观察转染效果.将最佳沉默siRNA导入HSC-T6细胞,RT-PCR分析各组的COL1A1mRNA表达水平.结果:靶向COL1A1mRNA的3个shRNA重组质粒载体pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C经测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功.1、2、3、4μg组转染效率分别为16.7%、20.3%、23.5%和22.3%,以2μgsiRNA为最佳剂量,pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C对COL1A1 mRNA的抑制率分别为16.6%,63.3%和80.3%.结论:筛选出的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C表达质粒能高效地抑制转染细胞COL1A1mRNA的表达,从而为肝纤维治疗提供新的方法和材料.

主 题 词：前Ⅰ型胶原α1链 肝星状细胞 RNA干扰 质粒 逆转录-聚合酶链反应 

学科分类：1001[医学-基础医学] 10[医学] 

D　O　I：10.11569/wcjd.v16.i15.1622

馆 藏 号：203625090...