人PTEN基因RNA干扰及其RESC救援慢病毒载体的构建与鉴定

作     者：王玉梅 盛光耀 WANG Yumei;SHENG Guangyao

作者机构：郑州大学第一附属医院儿科郑州450052 郑州大学第三附属医院儿内科郑州450052 美国圣路易斯华盛顿大学医学院血液系密苏里州631101093 

出 版 物：《郑州大学学报（医学版）》 (Journal of Zhengzhou University(Medical Sciences))

年 卷 期：2010年第45卷第3期

页      码：443-447页

摘      要：目的:构建人PTEN基因RNA干扰(RNAi)及其逃避RNAi策略结构(RESC)救援的慢病毒载体。方法:利用Invitrogen公司在线软件,针对已筛选确定的PTEN基因RNAi有效靶序列,设计并合成靶序列的oligo DNA,退火形成双链DNA,与经XbaⅠ和XhoⅠ酶切后的pFLRu-GFP载体连接构建成pFLRu-U6-shPTEN慢病毒载体。在此基础上,引入外源设计的PTENmRNA,与经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后的pFLRu-U6-shPTEN载体连接,从而产生在同一个载体内兼有人PTEN基因shRNA及其救援cDNA同时表达的RESC慢病毒载体pFLRu-U6-rrshPTEN。2者均转入到大肠杆菌XL10感受态细胞,制备质粒并用酶切及测序鉴定。分别用pFLRu-U6-shPTEN、pFLRu-U6-rrshPTEN与pCMV-dR8.2ΔR和pCMV-VSV-G质粒共转染293T包装细胞,包装产生2种慢病毒,收集病毒上清,系列稀释法检测病毒悬液的滴度。结果:氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆、酶切鉴定、U6前引物测序鉴定结果显示pFLRu-U6-shPTEN和pFLRu-U6-rrshPTEN均为阳性克隆,且2种慢病毒的滴度分别为6.6×105和5.6×105pfu/mL。结论:成功构建出人PTEN基因RNAi及其RESC慢病毒载体。有效地避免了由于脱靶效应所引起的假阳性结果对实验的干扰,为研究PTEN基因功能提供了稳定的转染细胞载体。

主 题 词：PTEN基因 慢病毒载体 RNA干扰 逃避RNA干扰策略结构 脱靶效应 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100214[100214] 10[医学] 

D　O　I：10.3969/j.issn.1671-6825.2010.03.031

馆 藏 号：203625948...