针对p27Kip1基因的小发夹RNA对牛角膜内皮细胞增殖的影响

作     者：黄渝侃 张明昌 王勇 范可顺 姜冬玲 张光红 周龚莉 HUANG Yu-kan

作者机构：华中科技大学同济医学院附属协和医院武汉430022 武汉爱尔眼科医院 

基　　金：湖北省自然科学基金资助项目(2004ABA250) 

出 版 物：《中华眼科杂志》 (Chinese Journal of Ophthalmology)

年 卷 期：2009年第45卷第3期

页      码：254-259页

摘      要：目的探讨针对p27Kip1基因的小发夹RNA（shRNA）表达质粒对牛角膜内皮细胞（bCEC）增殖能力的影响。方法实验研究。设计有发夹状结构的3条p27Kip1—shRNA对应模板DNA序列，并构建无关序列HK—shRNA作为阴性对照。构建并鉴定重组质粒Pgenesil-P1、Pgenesil-P2、Pgenesil—P3及Pgenesil-HK。以脂质体法将以上4种质粒分别转染bCEC，并设立空白组。稳定转染后采用RT-PCR和Westem免疫印迹法检测bcEc内p27Kip1的mRNA及其蛋白水平，筛选出抑制效果最好的阳性siRNA质粒。用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测该质粒组、Pgenesil-HK组及空白组的细胞生长情况。流式细胞术检测各组细胞周期的分布。以上数据结果均采用单因素方差分析。结果酶切及测序证实4个重组质粒均构建成功。与空白组比较，Pgenesil-P1、Pgenesil—P2、Pgenesil—P3各组mRNA的抑制效率分别为32．71％、67．76％及80．28％（F=453．102，P=0．000），蛋白表达水平降低为29．27％、64．73％及76．13％（F=75．385，P=0．000），以Pgenesil—P3抑制效果最明显。空白组与Pgenesil—HK组比较蛋白水平（P=0．356）和mRNA水平（P=0．246）均差异无统计学意义。与空白对照和阴性siRNA相比，Pgenesil—P3组bCEC增殖能力提高，G1期细胞比例下降（F=134．224，P=0．000），S期比例增加（F=334．957，P=0．000）。结论针对p27Kip1的shRNA可有效降低p27Kip1基因及其蛋白的表达水平，并可提高bCEC增殖能力。RNA干扰介导的p27Kip1基因沉默可能是促进角膜内皮细胞再生的有效手段。

主 题 词：RNA 小分子干扰 周期素依赖激酶抑制剂p27 质粒 内皮 角膜 细胞增殖 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100210[100210] 10[医学] 

核心收录：

D　O　I：10.3760/cma.j.issn.0412-4081.2009.03.014

馆 藏 号：203640999...