鸭甲肝病毒1型和3型间接ELISA方法的建立与应用

作     者：张玉瑶 马秀丽 黄兵 李玉峰 于可响 李建亮 刘存霞 韩宏宇 崔言顺 

作者机构：山东农业大学动物科技学院山东泰安271018 山东省农业科学院家禽研究所山东省家禽疫病诊断与免疫重点实验室山东济南250023 

基　　金：山东省现代农业产业技术体系项目(SDAIT-13-011-01) 山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(BS2009YY019) 山东省农业科学院青年科研基金项目(2014QNZ06) 国家自然科学基金面上项目(31172355/C1806)~~ 

出 版 物：《微生物学报》 (Acta Microbiologica Sinica)

年 卷 期：2015年第55卷第4期

页      码：501-509页

摘      要：【目的】研究鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)1型VP3和3型VP1串联基因在大肠杆菌中的表达,并以纯化的重组蛋白为抗原建立鸭病毒性肝炎抗体检测的间接ELISA方法。【方法】设计2对特异性引物,提取鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)和3型(DHAV-3)的RNA,分别RT-PCR扩增得到714bp的DHAV-1VP3和720bp的DHAV-3 VP1基因,并克隆至p MD18-T载体中,然后依次将DHAV-1 VP3和DHAV-3 VP1定向插入p ET-32a(+)表达载体,获得重组表达载体p ET-1VP3-3VP1,进行IPTG(Isopropyl-beta-D-1-thiogalactopyranoside)诱导表达分析,以纯化的重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法并应用于临床。【结果】经IPTG诱导表达,在大肠杆菌中可稳定、高效地表达DHAV-1VP3-3VP1蛋白。Western blot检测结果表明,表达的重组蛋白与DHAV-1和DHAV-3阳性血清均能发生特异性反应。确定间接ELISA方法的抗原最佳包被浓度为1.0μg/孔,血清最佳稀释度为1∶200,临界值为OD6 50值≥0.38,建立的间接ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。该方法与中和试验分别检测DHAV-3阳性血清,两种方法的符合率各为96.3%和96.7%;初步临床应用结果表明该方法可用于雏鸭母源抗体和免疫后抗体的消长变化的检测。【结论】以大肠杆菌表达的DHAV-1VP3-3VP1重组蛋白建立的间接ELISA方法可用于DHAV-1和DHAV-3抗体的检测。

主 题 词：鸭甲肝病毒1型 鸭甲肝病毒3型 VP1基因 VP3基因 表达 

学科分类：090601[090601] 1002[医学-临床医学类] 09[农学] 0906[农学-水产类] 

核心收录：

D　O　I：10.13343/j.cnki.wsxb.20140413

馆 藏 号：203665468...