转录因子Eha直接调控迟缓爱德华菌的靶基因

作     者：田畅 刘念 郑恩金 高大庆 陆承平 TIAN Chang;LIU Nian;ZHENG En-jin;GAO Da-qing;LU Cheng-ping

作者机构：东南大学医学院南京210009 南京农业大学动物医学院南京210095 

基　　金：国家自然科学基金项目(No.31570124)资助~~ 

出 版 物：《中国人兽共患病学报》 (Chinese Journal of Zoonoses)

年 卷 期：2019年第35卷第4期

页      码：299-310页

摘      要：目的 Eha是一种重要转录调控因子,它可以影响迟缓爱德华氏菌(Et)的胞内存活,本实验探究Eha直接调控的靶基因如何抵御巨噬细胞杀灭细菌的分子机制。方法构建pGEX-4T-ehaflag重组质粒,电击导入eha基因缺失株的ET-13菌,得到Cehaflag ET13重组菌;用Western blot检测重组菌Eha-Flag融合蛋白的表达,并用细菌胞内存活实验检测细菌EhaFlag融合蛋白的活性;我们釆用染色质免疫共沉淀(CHIP)技术,用抗Flag标签抗体对靶基因沉淀Eha-DNA片段,除去结合的蛋白并纯化DNA片段;以RNA-Sequencing的差异表达基因设计引物,以CHIP得到的DNA样品为模板,进行qRT-PCR; PCR扩增靶基因的启动子区域,构建了pBAD-P_靶lac Z重组质粒,电击分别导入ET-13野生株和eha基因缺失株,比较它们β-半乳糖苷酶活性的差异;SDS-PAGE电泳比较野生株和缺失株外膜蛋白、厌氧C4二羧酸转运蛋白DcuA1和鞭毛钩蛋白FlgK表达的差异,并用细菌胞内存活实验比较野生株和缺失株的差异。结果 Western blot表明,Cehaflag ET13重组菌能够表达Eha-Flag融合蛋白;细菌胞内存活实验表明,该融合蛋白完全可以恢复缺失株在胞内降低的生存能力,Flag融合标签不影响Eha蛋白的功能;通过qPCR鉴定CHIP,富集到Eha的结合靶点,最终筛选出10个Eha直接结合的基因;通过野生株和缺失株中β-半乳糖苷酶活性的差异,证明eha基因对5个靶基因启动子有直接调控作用;通过检测野生株和缺失株表型的差异,证明eha基因对靶蛋白DcuA1,TnaA和FlgK的表达和活性有调控作用。结论 Eha可以通过直接调控这些靶基因,使Et菌在巨噬细胞内的存活受到影响。

主 题 词：迟缓爱德华氏菌 转录调控因子 eha基因 CHIP 

学科分类：1007[医学-药学类] 100705[100705] 1001[医学-基础医学] 100103[100103] 10[医学] 

核心收录：

D　O　I：10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.027

馆 藏 号：203669656...