利用CRISPR/Cas9系统在Beta-TC-6细胞株中剔除Sidt2基因

作     者：吕康甲 梁飞腾 郑慧豪 张杨 徐海平 董莹莹 高家林 LU Kangjia;LIANG Feiteng;ZHENG Huihao;ZHANG Yang;XU Haiping;DONG Yingying;GAO Jialin

作者机构：皖南医学院临床医学院安徽芜湖241002 皖南医学院医学影像学院安徽芜湖241002 皖南医学院第一附属医院弋矶山医院内分泌科安徽芜湖241001 

基　　金：国家自然科学基金项目(81471002) 安徽省大学生创新创业训练计划项目(201710368134) 安徽省自然科学基金项目(1708085MH188) 

出 版 物：《皖南医学院学报》 (Journal of Wannan Medical College)

年 卷 期：2019年第38卷第3期

页      码：214-218页

摘      要：目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑系统和电穿孔技术,在小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞(Beta-TC-6)中剔除溶酶体膜蛋白Sidt2基因。方法:针对小鼠Sidt2基因设计向导RNA(sgRNA),sgRNA退火合成双链后克隆到px459载体中。测序鉴定成功的重组质粒命名为px459-Sidt2并大量扩增。使用NEPA21高效基因转染系统将px459-Sidt2重组质粒电转到Beta-TC-6细胞中,电转染48h后使用嘌呤霉素加压进行阳性细胞筛选。阳性细胞扩增冻存,得到Sidt2基因剔除混合克隆细胞株,提取细胞DNA及蛋白,利用T7酶以及Western blot方法检测细胞株中Sidt2的敲除效果。结果:成功构建靶向小鼠Sidt2基因的px459重组质粒px45-Sidt2。使用NEPA21高效基因转染系统电转Beta-TC-6的最佳电转参数为脉冲电压150V,脉冲时间5ms,脉冲间隔50ms,脉冲次数2次,电压衰减10%,电穿孔模式为正方向。与对照组细胞相比,嘌呤霉素加压筛选得到的Beta-TC-6阳性细胞中的Sidt蛋白表达缺失(P<0.05),成功在小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞(Beta-TC-6)中剔除溶酶体膜蛋白Sidt2基因。结论:利用CRISPR/Cas9基因编辑系统以及电穿孔技术,在相对难转染的小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞Beta-TC-6成功剔除Sidt2基因。

主 题 词：CRISPR/Cas9 电穿孔 Sidt2 Beta-TC-6 

学科分类：1001[医学-基础医学] 1010[医学-医学技术类] 10[医学] 

D　O　I：10.3969/j.issn.1002-0217.2019.03.003

馆 藏 号：203673384...