基于CRISPR/Cas9技术的miR-374a低表达细胞系的构建及鉴定

作     者：谢柱 李崇慧 方军 陈佳唯 李浩 寇志华 李军锋 周育森 XIE Zhu;LI Chong-hui;FANG Jun;CHEN Jia-wei;LI Hao;KOU Zhi-hua;LI Jun-feng;ZHOU Yu-sen

作者机构：军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所国家病原微生物生物安全重点实验室北京100071 蚌埠医学院生命科学学院安徽蚌埠233030 

基　　金：国家自然科学基金面上项目(31570158) 国家重点研发计划(2016YFC1201402) 病原微生物生物安全国家重点实验室自主课题(SKLPBS1431) 

出 版 物：《蚌埠医学院学报》 (Journal of Bengbu Medical College)

年 卷 期：2019年第44卷第5期

页      码：561-565页

摘      要：目的:运用CRISPR/Cas9技术构建miR-374a低表达细胞系。方法:设计针对miR-374a成熟体gRNA,合成DNA,插入pSpCas9(BB)-2A-Puro,将鉴定正确的载体转染入肺癌细胞系A549细胞,使用嘌呤霉素筛选转染的细胞;PCR方法扩增,序列测定分析细胞基因组中靶位点区域序列;定量PCR方法检测转染细胞中miR-374a及其靶基因TGFA的表达情况;细胞增殖实验检测miR-374a基因编辑对细胞生长情况的影响。结果:构建了靶向miR-374a成熟体基因序列的基因编辑载体,转染细胞经过加压筛选,序列分析结果提示靶向位点的基因发生了缺失或插入突变;定量PCR结果显示,转染基因编辑载体的细胞miR-374a表达水平较对照细胞明显下降(P<0.01),而靶基因TGFA表达则明显上升(P<0.05);细胞增殖实验显示miR-374a低表达的细胞增殖能力发生了明显改变(P<0.05~P<0.01)。结论:成功构建了miR-374a低表达细胞系,为后续研究该分子的功能提供了基础。

主 题 词：微小RNA-374a 转化生长因子 CRISPR/CAS9技术 细胞增殖 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 

D　O　I：10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2019.05.001

馆 藏 号：203679775...