猪肺炎支原体醛缩酶原核表达及致猪气管上皮细胞凋亡的研究

作     者：华利忠 王世杰 马丹夫 刘茂军 冯志新 刘蓓蓓 韦艳娜 于岩飞 邵国青 HUA Li-zhong;WANG Shi-jie;MA Dan-fu;LIU Mao-jun;FENG Zhi-xin;LIU Bei-bei;WEI Yan-na;YU Yan-fei;SHAO Guo-qing

作者机构：江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京农业大学江苏南京210014 

基　　金：江苏省农业科技自主创新项目CX(14)5038 国家自然科学基金项目(31400164) 江苏省青年基金项目(BK20140754) 

出 版 物：《动物医学进展》 (Progress In Veterinary Medicine)

年 卷 期：2019年第40卷第6期

页      码：17-22页

摘      要：为了研究Ⅱ类果糖二磷酸醛缩酶(FBA)是否为猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)的毒力因子,并参与其致病作用,根据已发表的猪肺炎支原体醛缩酶全基因序列设计特异性的引物,以猪肺炎支原体168株基因组为模板,通过Overlap PCR点突变扩增醛缩酶基因。将FBA克隆至pET-28a(+)载体后进行序列测定和分析,结果表明,FBA基因全长864 bp。将构建的重组表达质粒pET-28a(+)/FBA转化至大肠埃希菌BL21(DE3),通过筛选获得阳性克隆,重组工程菌在IPTG诱导下成功获得表达融合蛋白猪肺炎支原体Ⅱ类果糖二磷酸醛缩酶(Mhp FBA),大小约为35 ku。纯化蛋白并接种于猪气管上皮细胞至FBA终浓度分别为0、10、50、100、150、200μg/mL,孵育24 h后进行上清中丙酮酸浓度的检测和细胞凋亡检测。结果上清中丙酮酸浓度随着FBA浓度的上升,出现先极显著上升(P<0.01)、后急剧下降的现象;细胞平均凋亡率依次分别为3.54%、10.91%、13.99%、27.19%、32.84%和40.71%,并随着FBA浓度的升高而升高,且相比阴性对照组差异均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)。成功构建了Mhp FBA重组菌,表达获得了Mhp重组蛋白FBA,该蛋白可能为猪肺炎支原体的毒力因子,参与猪肺炎支原体的致病作用,从而为进一步开展Mhp致病机理和药物研究奠定基础。

主 题 词：猪肺炎支原体 果糖二磷酸醛缩酶 原核表达 气管上皮细胞 凋亡 

学科分类：090601[090601] 09[农学] 0906[农学-水产类] 

D　O　I：10.3969/j.issn.1007-5038.2019.06.004

馆 藏 号：203680403...