小分子G蛋白Rap1 shRNA表达载体的构建和鉴定

作     者：郑霞 贺爱兰 叶启发 蒋圣军 ZHENG Xia;HE Ai-lan;YE Qi-fa;JIANG Sheng-jun

作者机构：荆州市中心医院妇产科中国湖北荆州430043 湖南人文科技学院生命科学系中国湖南娄底417000 中南大学湘雅三医院卫生部器官移植中心中国湖南长沙410013 北京市垂扬柳医院北京市微创医院中国北京100710 

基　　金：卫生部重大支持项目(43011004541) 

出 版 物：《生命科学研究》 (Life Science Research)

年 卷 期：2009年第13卷第2期

页      码：142-145页

摘      要：应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术抑制Rap1基因的表达,构建Rap1 shRNA(small hairpin RNA,shRNA)表达载体,观察其对小鼠肝脏细胞中Rap1 mRNA和蛋白表达的干扰作用.根据小鼠Rap1 mRNA的全序列,设计了3种Rap1 siRNA序列(Rap1 siRNA1、Rap1 siRNA2、Rap1 siRNA3)和阴性对照序列(HK);采用克隆技术,将其插入带有报告基因绿色荧光(EGFP)的pGenesil-3载体,构建Rap1 shRNA表达载体;经双酶切和测序证实Rap1 siRNA表达载体克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致;昆明小鼠40只,体重18～20g,随机分成4组:Ⅰ组(转染HK组)﹑Ⅱ组(转染Rap1 shRNA1组)﹑Ⅲ组(转染Rap1 shRNA2组)﹑Ⅳ组(转染Rap1 shRNA3组).于0﹑16﹑24h腹腔内注射Rap1 shRNA2.0～2.5mg/kg(用PBS稀释至1mL);48h后收集小鼠肝脏,用显微荧光﹑定量RT-PCT﹑免疫组化检测小鼠肝细胞中Rap1shRNA的转染率﹑Rap1基因表达以及蛋白质表达水平.Ⅰ组﹑Ⅱ组﹑Ⅲ组﹑Ⅳ组小鼠肝脏细胞体内转染率均大于60%,Ⅱ组﹑Ⅲ组﹑Ⅳ组的Rap1 mRNA表达﹑Rap1蛋白表达均降低,其中Rap1 shRNA1干扰效果最佳.

主 题 词：Rap1 siRNA shRNA 小鼠肝细胞 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 071007[071007] 

D　O　I：10.16605/j.cnki.1007-7847.2009.02.017

馆 藏 号：203680519...