重组人乙酰胆碱酯酶基因在毕赤酵母中分泌表达及其对农药的敏感性评估

作     者：杨芳芳 李佳慧 张赛南 王珍 廖志银 王首锋 YANG Fangfang;LI Jiahui;ZHANG Sainan;WANG Zhen;LIAO Zhiyin;WANG Shoufeng

作者机构：浙江大学基础医学系杭州310058 绿城农科检测技术有限公司杭州310052 浙江省微生物生化与代谢工程省级重点实验室杭州310058 

基　　金：国家发展改革委“微生物制造、绿色农用生物产品高技术产业化”专项(20111158) 

出 版 物：《浙江大学学报（农业与生命科学版）》 (Journal of Zhejiang University:Agriculture and Life Sciences)

年 卷 期：2019年第45卷第3期

页      码：317-324页

摘      要：乙酰胆碱酯酶是用酶抑制法检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的关键用酶,本研究利用毕赤酵母表达系统分泌表达人乙酰胆碱酯酶,并评估其对8种农药的敏感性,为工业化大规模生产高敏感性酶源奠定基础。根据GenBank上已发表的人乙酰胆碱酯酶(human acetylcholinesterase,hAChE)基因核酸序列设计引物,从pReceiver-M02-hAChE-ORF质粒中扩增出hAChE的开放阅读框(open reading frame,ORF)片段,接着利用SnaBⅠ和AvrⅡ双酶切将其克隆至载体pPIC9K中,构建pPIC9K-hAChE表达载体,然后将SalⅠ线性化的pPIC9K-hAChE电转化至毕赤酵母GS115中,在含4.00mg/mLG418抗性平板上筛选获得阳性克隆,最后经0.5%甲醇诱导分泌表达144h,发现其发酵上清液的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱在65kDa处有一条明显的蛋白条带,大小与预期的hAChE蛋白一致。利用Q-Sepharose FF柱层析法对其总蛋白进行纯化,获得了较纯的人乙酰胆碱酯酶。用Bradford法测得发酵上清液中hAChE蛋白质量浓度为1.330mg/mL,占总蛋白的5.58%,纯化后比酶活达到1080nmol(/ min mL)。通过初步计算比对重组工程菌发酵上清液对8种常见农药的半抑制浓度,得出敌百虫>敌敌畏>克百威>马拉硫磷>乐果>甲胺磷>甲萘威>毒死蜱,即人乙酰胆碱酯酶对毒死蜱最敏感。

主 题 词：人乙酰胆碱酯酶 毕赤酵母 分泌表达 蛋白纯化 酶活测定 农药敏感性 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 082203[082203] 0822[工学-核工程类] 

核心收录：

D　O　I：10.3785/j.issn.1008-9209.2018.09.281

馆 藏 号：203688540...