新型双功能谷胱甘肽合成酶的真核和原核表达

作     者：李佳慧 杨芳芳 王珍 张赛南 王首锋 LI Jiahui;YANG Fangfang;WANG Zhen;ZHANG Sainan;WANG Shoufeng

作者机构：浙江大学基础医学系浙江杭州310058 绿城农科检测技术有限公司浙江杭州310052 浙江省微生物生化与代谢工程省级重点实验室浙江杭州310058 

基　　金：国家发展和改革委员会微生物制造、绿色农用生物产品高技术产业化专项(20111158) 

出 版 物：《浙江大学学报（理学版）》 (Journal of Zhejiang University（Science Edition）)

年 卷 期：2019年第46卷第4期

页      码：474-481页

摘      要：通过裂解无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)菌体细胞得到基因组DNA。根据GenBank上已发表的无乳链球菌(菌种编号ATCC13813)新型双功能谷胱甘肽合成酶基因(gshF)的核酸序列与2种不同表达载体多克隆位点序列,分别设计引物F1、R1和F2、R2,再以总DNA为模板,经过特异性PCR扩增出长度约为2200bp的目的基因。随后分别对目的基因gshF和2种表达载体进行双酶切、连接等操作,得到表达载体pPIC9K-gshF与pET-gshF。用SalI线性化表达载体pPIC9K-gshF后电转至毕赤酵母GS115中。经MD平板筛选重组子、菌落PCR鉴定阳性菌株、G418抗性梯度平板筛选多拷贝菌株,最终在4.0mg·mL^-1G418抗性平板上筛选出阳性菌株。用甲醇终浓度为2%的BMMY培养基诱导该阳性菌株表达,每隔12h取样并添加甲醇,96h后离心收集发酵上清,经SDS-PAGE蛋白电泳显示:在85kDa处出现1条明显蛋白带,大小与预期GshF蛋白一致。重组菌BL21-pET-gshF用IPTG诱导表达,先在37℃下培养90min,再加入IPTG至1mmol·L^-1后诱导7h,离心收集表达产物并对重组菌进行超声破碎处理后,进行SDS-PAGE蛋白电泳,同样在85kDa处有1条蛋白带。采用Bradford法测定2种表达产物上清的蛋白量,其中重组酵母表达上清中蛋白量为0.46mg·mL^-1,重组大肠杆菌表达产物破壁后的蛋白量为1.46mg·mL^-1。测定并比较2种不同表达方式所得酶活,发现GshF在毕赤酵母表达中的比酶活仅为14.15U·mL^-1,经原核表达后比酶活可达62.15U·mL^-1。

主 题 词：新型双功能谷胱甘肽合成酶 发酵表达 谷胱甘肽 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 09[农学] 

核心收录：

D　O　I：10.3785/j.issn.1008-9497.2019.04.014

馆 藏 号：203699087...