小鼠NOMO1基因RNA干扰载体的构建及其功能的初步研究

作     者：沈震 陈欢欢 张浩 盛燕辉 杨荣 孔祥清 

作者机构：南京医科大学第一附属医院心内科江苏南京210029 泰州市人民医院心内科江苏泰州225300 南京医科大学第一附属医院内分泌科江苏南京210029 

基　　金：国家自然科学基金青年科学基金(30901473) 

出 版 物：《南京医科大学学报（自然科学版）》 (Journal of Nanjing Medical University(Natural Sciences))

年 卷 期：2012年第32卷第12期

页      码：1661-1665页

摘      要：目的:构建小鼠NOMO1基因RNA干扰载体,比较其对P19细胞NOMO1基因的抑制效率,以研究NOMO1基因与P19细胞向心肌细胞方向分化的关系。方法:利用Designer3.0软件设计小鼠NOMO1基因干扰片段,合成shRNA序列,再行寡核苷酸双链的合成,退火后形成的寡核苷酸双链克隆到pGPU6/Hygro载体的黏性末端,连接产物转化到感受态细胞,增菌,质粒扩增,质粒DNA抽提,使用PstⅠ、BamHⅠ进行双酶切和DNA测序鉴定重组克隆。将小鼠NOMO1基因RNA干扰载体转染P19细胞,以RT-PCR技术验证NOMO1基因在P19细胞中的mRNA表达。以DMSO诱导分化方案诱导P19细胞向心肌细胞分化,采用定量RT-PCR技术检测P19细胞中α-MHC等基因mRNA的表达,评估NOMO1与P19干细胞向心肌细胞方向分化的关系。结果:双酶切证实shRNA正确插入质粒,测序结果表明插入的序列正确。载体转染的P19细胞筛选稳定表达株,经RT-PCR和Western blot验证4个位点设计的干扰质粒对NOMO1在P19细胞中的mRNA表达均具有较高的抑制效率。转染后P19细胞的α-MHC基因mRNA表达则显著下调(P<0.05)。结论:成功构建小鼠NOMO1基因RNA干扰载体,为研究NOMO1基因与P19细胞向心肌细胞方向分化的关系提供了稳定的转染细胞工具,NOMO1可能通过诱导α-MHC等基因表达,促进P19干细胞向中胚层的分化。

主 题 词：先天性心脏病 NOMO1基因 RNA干扰 RNA干扰载体 P19细胞 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 071007[071007] 

馆 藏 号：203704139...