新型10-23脱氧核酶表达载体的构建及其效能研究

作     者：李俊明 万腊根 张才成 王娜 罗清 LI Jun-ming;WAN La-gen;ZHANG Cai-cheng;WANG Na;LUO Qing

作者机构：南昌大学第一附属医院检验科330006 

基　　金：国家自然科学基金(30600528) 

出 版 物：《中华医学杂志》 (National Medical Journal of China)

年 卷 期：2009年第89卷第38期

页      码：2708-2712页

摘      要：目的构建一种新型10-23脱氧核酶（DZ）真核表达载体，并鉴定其在细胞内表达10—23DZ的能力以及10-23DZ抑制巨噬细胞TACO表达的效果。方法设计1条寡脱氧核糖核苷酸ODN—PSL，其序列包含鼠莫洛尼白血病病毒逆转录酶（MLV—RT）的引物结合序列、1个多克隆酶切位点（MCS）及1个逆转录终止信号序列。将ODN—PSL插入框架质粒pBUDCE4．1中启动子PCMV的下游，获取重组质粒pBUD—PSL。将MLV—RT的编码基因克隆至pBUD—PSL中另一启动子PEF-1a的下游，构建重组质粒pSDE01。将pSDE01转染入鼠巨噬细胞系RAW264．7细胞，采用RT—PCR方法鉴定细胞中MLV-RT的表达及其表达产物的逆转录酶活性。通过计算机软件模拟巨噬细胞TACOmRNA的二级结构，以此确定10-23DZ的作用靶位并设计一相应的10—23DZ——DZ1，将DZ1表达序列插入pSDE01中ODN—PSL的MCS中，获取重组表达载体pSDE01-DZ1。将pSDE01-DZ1转染入RAW264．7细胞，并设未转染对照组。转染后48h，采用PCR法和斑点杂交方法鉴定DZ1在细胞中的表达；并分别采用半定量RT-PCR和蛋白质印迹法检测TACO mPNA和蛋白的表达，各组实验均独立重复3次。结果限制性内切酶酶切及测序结果显示pSDE01构建成功，将其转染入RAW264．7细胞后检测到MLV-RT的表达，而且表达产物具有逆转录酶活性。pSDE01-DZ1转染入RAW264．7细胞后48h，PCR和斑点杂交方法均检测到DZ1的表达；半定量RT-PCR和蛋白质印迹检测结果显示，与未转染组相比，pSDE01-DZ1转染后48h巨噬细胞TACOmRNA表达水平下降了77．7％（0．193±0．008比0．864±0．005，P〈0．05），TACO蛋白表达量下降了73．3％（0．114±0．051比0．427±0．043，P〈0．05）。结论成功构建了一种操作简便的新型10—23DZ表达载体，所携带的特异性10-23DZ可在细胞内有效表达，并抑制相应靶基因的表达。

主 题 词：DNA,催化性 表达载体 微丝蛋白质类 巨噬细胞 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100210[100210] 10[医学] 

核心收录：

D　O　I：10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2009.38.015

馆 藏 号：203717974...