骨髓基质细胞中Von Hippel-Lindau基因的siRNA表达载体构建及其检测

作     者：邹多宏 赵君 夏伦果 张秀丽 蒋欣泉 黄远亮 ZOU Duo-hong;ZHAO Jun;XIA Lun-guo;ZHANG Xiu-li;JIANG Xin-quan;HUANG Yuan-liang

作者机构：同济大学口腔医学院上海200072 同济大学附属东方医院口腔科上海200120 上海交通大学医学院附属第九人民医院.口腔医学院口腔颌面外科上海200011 上海交通大学医学院附属第九人民医院.口腔医学院口腔组织工程实验室上海200011 

基　　金：上海市科学技术委员会资助项目(9411954800) 上海市口腔医学重点实验室开放基金(S30206) 

出 版 物：《上海口腔医学》 (Shanghai Journal of Stomatology)

年 卷 期：2010年第19卷第4期

页      码：403-409页

摘      要：目的:构建骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells BMSCs)中Von Hippel-Lindau(VHL)基因的siRNA表达载体并检测其对BMSCs细胞中VHL基因的干扰作用。方法:根据犬的VHL基因序列设计并合成4对siRNA oligo,然后用载体构建试剂盒进行重组克隆,将4对双链的siRNA oligo分别插入到siRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR中,构建4个siRNA表达质粒(SR144-1,SR144-2,SR144-3,SR144-4)。用载体通用引物进行菌落PCR筛选,筛选得到的阳性克隆进行测序,以验证重组克隆中插入片段序列是否与设计的oligo序列一致。干扰载体瞬时转染BMSCs,通过qPCR和Western印迹分别检测干扰载体对目的基因的沉默效果。为了提高转染效率及VHL基因的沉默效果,对SR144-4进行慢病毒干扰载体(pLenti-mi-VHL)构建。结果:通过对构建质粒克隆进行测序,证实重组克隆中插入片段序列与设计的oligo序列一致,转染BMSCs细胞24h和48h后分别用qPCR与Western印迹检测,显示SR144-4干扰效果最理想。通过测序结果比对,插入序列完全正确,pLenti-mi-VHL构建成功。结论:成功构建了BMSCs的siRNA-VHL表达载体,为进一步实验研究奠定了基础。

主 题 词：VonHippel-Lindau基因 骨髓基质细胞 siRNA干扰 低氧诱导因子 

学科分类：1001[医学-基础医学] 10[医学] 

馆 藏 号：203718288...