二代靶向测序在CRISPR/Cas9靶区筛选中的应用性研究

作     者：吴海波 边雪娇 贾丽玲 索伦 WU Haibo;BIAN Xuejiao;JIA Liling;SUO Lun

作者机构：上海交通大学医学院附属第九人民医院上海200011 上海交通大学系统生物医学研究院上海200240 

基　　金：国家重点研发项目(2018YFC1003004) 

出 版 物：《畜牧兽医学报》 (ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA)

年 卷 期：2019年第50卷第8期

页      码：1587-1595页

摘      要：旨在利用二代靶向测序技术比较不同靶区对CRISPR/Cas9基因编辑结局的影响,为该技术应用过程中的靶区筛选提供技术参考。本研究进行如下试验:1)以小鼠Pyk2基因为研究对象,针对其第一外显子区设计3个靶区,通过打靶质粒构建、细胞转染及转染细胞DNA二代靶向测序等手段发现,不同靶区总体的基因编辑(Indels)效率相差较大(site1:32.0%;site2:7.9%;site3:69.5%),编辑修复的偏好性也存在较大区别;而对于同一靶区,总编辑效率在2组试验重复中较为稳定(site1:31.8%vs 32.3%;site2:7.4%vs 8.4%;site3:71.3%vs 67.8%),编辑的偏好性也相对一致;2)针对上述筛出的最佳靶区site1,通过sgRNA与Cas9体外转录、小鼠胚胎显微注射和移植及子代的基因型鉴定等手段,结果发现,上述靶区的基因编辑偏好性在基因编辑动物生产中也得到证实;3)利用上述得到的site1靶区插入一个碱基的突变小鼠,在原靶区位置设计与site1仅相差一个碱基的sgRNA。通过突变小鼠基因组PCR和Cas9酶体外切割试验发现,靶区切割位点单碱基的插入就对该靶区编辑的效率产生显著影响(49.2%vs 0%)。综上所述,靶区选择对CRISPR/Cas9基因编辑的结局影响显著,通过二代靶向测序可以有效筛选CRISPR-Cas9基因编辑靶区,并在模式动物生产过程中也获得较好的结果。此外,针对靶区切割位点的单个碱基插入对基因编辑效率影响显著。

主 题 词：靶向测序 CRISPR/Cas9 基因编辑 Pyk2 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 08[工学] 0905[农学-林学类] 09[农学] 071007[071007] 0836[0836] 090501[090501] 

核心收录：

D　O　I：10.11843/j.issn.0366-6964.2019.08.007

馆 藏 号：203740705...