结合单酶切位点的融合PCR技术对SCN1A基因的定点诱变

作     者：龙跃生 蔡阳林 赵绮华 廖卫平 LONG Yue-sheng;CAI Yang-lin;ZHAO Qi-hua;LIAO Wei-ping

作者机构：广州医学院第二附属医院神经科学研究所广东广州510260 

基　　金：国家自然科学基金项目(30600198) 广东省自然科学基金项目(06301101) 

出 版 物：《激光生物学报》 (Acta Laser Biology Sinica)

年 卷 期：2008年第17卷第6期

页      码：824-828页

摘      要：目的:利用结合单酶切位点的融合PCR技术对癫痫相关基因SCN1A进行定点突变。方法:首先设计两对引物PF1/PR1和PF2/PR2,PF1和PR2均位于突变位点最近的单酶切位点处,而突变位点设计在第一对反向引物(PR1)和第二对正向引物上(PF2)。通过重叠延伸法两次PCR扩增:第一次用PF1/PR1和PF2/PR2分开扩增,以扩增产物作模板,PF1/PR2作引物进行融合PCR,得到的扩增产物即含有所需要的突变位点,最后将扩增片段克隆入pMD18-T载体,经测序筛选阳性克隆。结果:DNA测序表明SCN1A基因所编码的第946位密码子由精氨酸(Arg)突变为组氨酸(His),再通过酶切和连接反应将重组质粒上的突变片段替换SCN1A表达质粒上的对应片段,成功构建了SCN1A突变载体。结论:与现在常用的长距离PCR定点诱导突变相比较,结合单酶切位点的融合PCR定点突变技术具备扩增距离短的优点,大大降低了自发突变的概率,适合于大肠杆菌中易自发突变的较大载体的定点诱变。

主 题 词：融合PCR 定点诱变 SCN1A 癫痫 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100204[100204] 10[医学] 

D　O　I：10.3969/j.issn.1007-7146.2008.06.022

馆 藏 号：203748261...