应用CRISPR/Cas9构建稳定表达CPV结构蛋白VP2的HEK293T细胞系

作     者：骆茹梦 刘媛 朱记平 李毅 LUO Ru-meng;LIU Yuan;ZHU Ji-ping;LI Yi

作者机构：武汉生物工程学院生命科学与技术学院应用生物技术研究中心 

基　　金：国家自然科学基金资助项目(31470268) 湖北省自然科学基金资助项目(2017CFB228) 

出 版 物：《中国兽医学报》 (Chinese Journal of Veterinary Science)

年 卷 期：2019年第39卷第8期

页      码：1476-1483页

摘      要：为了构建犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)结构蛋白VP2稳定表达的HEK293T细胞系,以2017年新分离的CPV-WH株为材料,扩增其VP2基因,并进行进化树分析。根据安全插入位点AAVS1位点序列设计sgRNA,并构建Cas9及sgRNA的表达载体PX335-U6-sgRNA-Cas9,同时构建含有VP2的特异性同源序列的片段HM-puro-eGFP-VP2-HA,将两者共转染HEK293T细胞后,通过嘌呤霉素筛选稳定表达VP2的HEK293T细胞株,并通过测序确定VP2正确插入。进化树分析显示CPV-WH的VP2存在S557N、T570K 2个氨基酸突变,该氨基酸位点可能与病毒免疫逃逸有关。通过荧光观察和免疫印迹确定了稳定表达细胞系中VP2的表达。本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了表达CPV结构蛋白VP2的HEK293T细胞,为后期制备CPV样颗粒提供细胞模型。

主 题 词：CPV VP2 CRISPR/Cas9技术 稳定表达 

学科分类：090601[090601] 09[农学] 0906[农学-水产类] 

D　O　I：10.16303/j.cnki.1005-4545.2019.08.10

馆 藏 号：203776034...