GGTA1/β4GalNT2双基因敲除的巴马小型猪PFFs细胞系的建立

作     者：厉小雪 李楚 任雪洋 王盈 杨海元 戴一凡 Li Xiaoxue;Li Chu;Ren Xueyang;Wang Ying;Yang Haiyuan;Dai Yifan

作者机构：南京医科大学江苏省异种移植重点实验室 

基　　金：国家重点研发计划(2017YFC1103701 2017YFC1103702) 

出 版 物：《实用器官移植电子杂志》 (Practical Journal of Organ Transplantation(Electronic Version))

年 卷 期：2019年第7卷第4期

页      码：277-282页

摘      要：目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立巴马小型猪胚胎成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)α-1,3-半乳糖基转移酶(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)/β-1,4 N-乙酸氨基半乳糖转移酶(β-1,4 N-acetylgalactosaminyltransferase,β4GalNT2)双基因敲除细胞系,为构建α-1,3-半乳糖(α-1,3-galactose,α-Gal)和SD(a)抗原缺失的巴马小型猪模型奠定基础。方法分别选取猪GGTA1基因的第三外显子和β4GalNT2基因的第八外显子为敲除靶点,利用在线工具(http://***)设计并合成单导向RNA(single guide RNA,sgRNA),以含有Cas9基因的pX330质粒为骨架构建打靶载体,转染野生巴马小型猪的PFFs,用T7EN1酶切验证打靶载体敲除效率。将打靶载体与G418抗性质粒(tdTomato)共转染巴马小型猪PFFs,经药物筛选获得阳性单细胞克隆后测序鉴定基因型。结果成功构建靶向GGTA1和β4GalNT2基因的Cas9/sgRNA表达载体。转染PFFs后用药物筛选得到31个单克隆细胞系,其中5个为GGTA1/β4GalNT2双基因敲除的细胞系。结论Cas9/sgRNA表达载体可以高效编辑PFFs的GGTA1/β4GalNT2基因并获得了双基因敲除的单细胞克隆,为构建GGTA1/β4GalNT2敲除的巴马小型猪提供必需的实验材料。

主 题 词：巴马小型猪 CRISPR/Cas9 猪胚胎成纤维细胞 α-1,3-半乳糖基转移酶/β-1,4 N-乙酸氨基半乳糖转移酶基因 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100214[100214] 10[医学] 

D　O　I：10.3969/j.issn.2095-5332.2019.04.007

馆 藏 号：203777466...