慢病毒介导的大鼠肝BRL-3A细胞Tmub1基因沉默及稳定感染细胞系的建立

作     者：王晓枫 刘孟刚 刘宏鸣 周波 王宝林 陈红旭 陈平 WANG Xiao-feng;LIU Meng-gang;LIU Hong-ming;ZHOU Bo;WANG Bao-lin;CHEN Hong-xu;CHEN Ping

作者机构：武警总医院肝脏移植研究所北京100039 第三军医大学大坪医院肝胆外科重庆400042 

基　　金：国家自然科学基金面上项目(30972895) 

出 版 物：《现代生物医学进展》 (Progress in Modern Biomedicine)

年 卷 期：2012年第12卷第16期

页      码：3019-3025页

摘      要：目的:构建Tmub1基因慢病毒干扰载体,建立稳定转染细胞系,检测大鼠肝BRL-3A细胞中Tmub1基因表达的干扰效果。方法:设计并构建4对针对大鼠Tmub1基因的特异性shRNA干扰质粒,酶切鉴定、DNA测序所得质粒。将由pRSV-Rev、pMDLg-pRRE、pMD2G和pll3.7干扰质粒组成的包装系统共转染293T细胞,产生慢病毒。所得慢病毒感染大鼠正常肝细胞BRL-3A,Western Blot检测不同靶点RNAi后Tmub1蛋白表达情况,确定有效靶点。针对有效靶点大量包装慢病毒。测定病毒滴度并以最适感染复数(multiplicity of infection,MOI)感染BRL-3A细胞后,G418抗生素筛选稳定感染细胞系BRL-3A/256。RT-PCR和Western Blot检测各组细胞Tmub1 mRNA和蛋白质的表达差异。结果:结果显示Tmub1 RNAi慢病毒载体构建成功,C0020Sh2-Hops-256干扰靶点RNAi效果最强。成功包装Tmub1基因RNAi慢病毒,测定病毒滴度为2.3×108TU/ml,对293T细胞的最适感染复数为60。成功建立Tmub1 RNAi慢病毒载体稳定感染细胞系BRL-3A/256,且在该细胞系中Tmub1 mRNA和蛋白质表达明显降低。结论:成功构建Tmub1 RNAi慢病毒载体,有效干扰BRL-3A细胞中Tmub1 mRNA和蛋白表达;成功筛选出Tmub1RNAi慢病毒稳定感染细胞系BRL-3A/256。

主 题 词：Tmub1 RNA干扰 慢病毒载体 BRL-3A 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100201[100201] 10[医学] 

D　O　I：10.13241/j.cnki.pmb.2012.16.026

馆 藏 号：203780814...