利用CRISPR/Cas9系统构建Lrtm1基因敲除的C2C12细胞系

作     者：李浩可 何衍佶 时迎旭 杨丹 尹凤 高彦飞 聂茂 邓忠良 Li Haoke;He Yanji;Shi Yingxu;Yang Dan;Yin Feng;Gao Yanfei;Nie Mao;Deng Zhongliang

作者机构：重庆医科大学附属第二医院骨科 

基　　金：国家自然科学基金资助项目(编号:81501867) 

出 版 物：《重庆医科大学学报》 (Journal of Chongqing Medical University)

年 卷 期：2019年第44卷第9期

页      码：1127-1133页

摘      要：目的:利用CRISPR/Cas9技术构建稳定敲除Lrtm1(leucine-rich repeats and transmenbrane domains 1)基因的C2C12细胞系,为研究Lrtm1基因的作用提供实验基础。方法:设计3对针对Lrtm1基因的向导RNA(sgRNA),将sgRNA插入载体pCRISPRLvSG06中;利用慢病毒包装系统包装含有sgRNA的重组质粒pCRISPR-LvSG06;将病毒感染C2C12细胞,并加入嘌呤霉素筛选,将筛选嘌呤霉素阳性的细胞提取RNA,逆转录成c DNA;设计Cas9引物,利用cDNA为模版,PCR验证C2C12细胞中Cas9的表达,确认慢病毒成功感染C2C12细胞;利用96孔板挑选单克隆细胞的方法筛选得到单克隆细胞;将扩增的单克隆细胞提取基因组DNA,测序Lrtm1基因相关序列并与野生型Lrtm1基因进行对比,确认敲除成功的克隆细胞株;诱导敲除Lrtm1稳定细胞株成肌分化,检测成肌分化标志因子Myosin的蛋白表达,RT-PCR检测转录因子PAX7的mRNA表达,Western blot检测H3K27me3蛋白水平。结果:测序结果显示向导RNA(sgRNA)成功插入载体质粒;将单克隆细胞DNA测序结果显示A和C克隆成功敲除Lrtm1基因;敲除Lrtm1基因后成肌分化标志因子Myosin蛋白表达降低,成肌转录因子PAX7 mRNA的表达降低,在分化72和96 h组,H3K27me3蛋白水平较野生型组增高。结论:利用CRISPR/Cas9技术成功敲除Lrtm1基因,稳定敲除Lrtm1基因的C2C12细胞系构建成功;敲除Lrtm1后能抑制C2C12细胞成肌分化,并且抑制成肌转录因子PAX7的m RNA表达,PAX7mRNA表达降低的原因可能为H3K27me3水平增高。

主 题 词：Lrtm1 CRISPR/cas9 基因敲除 C2C12 

学科分类：1001[医学-基础医学] 10[医学] 

D　O　I：10.13406/j.cnki.cyxb.002235

馆 藏 号：203792100...