牛病毒性腹泻病毒链特异性SYBR Green荧光定量PCR方法的建立及应用

作     者：刘存 邓永 梁琳 李金祥 张彦明 崔尚金 LIU Cun;DENG Yong;LIANG Lin;LI Jinxiang;ZHANG Yanming;CUI Shangjin

作者机构：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193 西北农林科技大学动物医学院杨凌712100 中国兽医药品监察所北京100081 农业部兽用药物与诊断技术北京科学观测实验站北京100193 

基　　金：农业科技创新工程项目(ASTIP-IAS15) 

出 版 物：《畜牧兽医学报》 (ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA)

年 卷 期：2019年第50卷第10期

页      码：2079-2087页

摘      要：为了对牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)复制过程中正、负链RNA进行定量检测,通过生物学软件DNAStar和Primer express 3.0设计BVDV正、负链RNA特异性反转录引物并在其5′端添加非病毒核苷酸标签序列以区分BVDV正、负链RNA。同时设计荧光定量PCR引物与非病毒核苷酸标签序列组成引物对,建立了BVDV链特异性荧光定量RT-PCR(ssRT-qPCR)方法,对其敏感性、重复性、特异性进行评估并利用所建立BVDV ssRT-qPCR对不同接毒剂量下BVDV在细胞内复制过程中正、负链RNA进行定量检测。结果表明,以构建的pMD18T-BV+和pMD18T-BV-质粒为标准品建立的BVDV正链特异性荧光定量RT-PCR方法[ss(+)RT-qPCR]和负链特异性荧光定量RT-PCR方法[ss(-)RT-qPCR]在10 2~10 7拷贝范围内具有良好的线性关系,线性相关系数分别为0.998 1和0.995 3;敏感性试验结果显示,ssRT-qPCR敏感性较好,ss(+)RT-qPCR最低检测下限为10拷贝,ss(-)RT-qPCR最低检测下限为100拷贝。重复性试验结果显示,所建立的ssRT-qPCR批内和批间的变异系数为均小于1%,方法重复性良好。特异性试验显示,所建立的ssRT-qPCR方法与牛副流感病毒3型、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒等不存在交叉反应,特异性较好。利用建立的ssRT-qPCR对不同感染剂量下细胞内BVDV正、负链RNA进行定量分析,结果显示以10、0.1 MOI剂量接种BVDV于MDBK细胞后,BVDV正、负链RNA变化呈现先升后降再逐渐上升的趋势。以1 MOI剂量感染MDBK细胞,BVDV正、负链RNA的动态变化趋势略有差异,整体呈上升趋势。10、1 MOI接毒剂量接种细胞后,BVDV正、负链RNA在感染后36 h基本维持稳定水平,以0.1 MOI接种细胞后BVDV正、负链RNA在感染后24 h即达到稳定水平。BVDV链特异性检测进一步验证了所建立方法的适用性。该研究建立了BVDV链特异性荧光定量RT-PCR方法并利用该方法对BVDV在细胞内复制过程中正、负链RNA的动态变化过程进行描述,为研究宿主蛋白抗病毒机制、BVDV基因组RNA复制及调控机制等研究提供了研究手段。

主 题 词：牛病毒性腹泻病毒 非病毒核苷酸序列标签 荧光定量PCR方法 

学科分类：090601[090601] 09[农学] 0906[农学-水产类] 

核心收录：

D　O　I：10.11843/j.issn.0366-6964.2019.10.014

馆 藏 号：203818374...