大鼠细胞因子信号转导抑制因子3基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

作     者：张旭 刘正娟 翟娜 王玉川 ZHANG Xu;LIU Zheng-juan;ZHAI Na;WANG Yu-chuan

作者机构：嘉兴市第二医院儿科浙江嘉兴314000 大连医科大学附属第二医院儿科辽宁大连116027 

基　　金：国家自然科学基金(30771798) 辽宁省自然科学基金(20072165) 

出 版 物：《实用儿科临床杂志》 (Journal of Applied Clinical Pediatrics)

年 卷 期：2010年第25卷第10期

页      码：756-759页

摘      要：目的研究构建大鼠细胞因子信号转导抑制因子3(SOCS3)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体的方法。方法根据大鼠SOCS3基因(NM053565),用Ambion在线软件选择3个靶序列,设计并合成包含各正反义靶序列的互补单链寡核苷酸,与经BamHⅠ和XhoⅠ酶切后的慢病毒载体质粒pRNA-Lenti-绿色荧光蛋白(GFP)(含U6启动子和GFP)连接产生pRNA-Lenti-SOCS3-GFP慢病毒重组质粒,然后分别转染C6大鼠神经胶质瘤细胞,通过荧光显微镜观察细胞转染情况,利用荧光实时定量PCR方法检测RNAi组(siRNA1、siRNA2、siRNA3),空白细胞组和阴性序列组(siRNA-Negative)SOCS3的表达情况,筛选出干扰效果最佳的重组质粒。此慢病毒重组质粒与慢病毒包装混合物共转染293T细胞,包装产生慢病毒,收集病毒上清,采取系列稀释法测定慢病毒滴度。结果将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功。荧光实时定量PCR检测显示慢病毒重组质粒感染C6大鼠神经胶质瘤细胞后,与空白细胞组比较,3个RNAi组均不同程度地抑制SOCS3表达,其中siRNA1组抑制效果最佳,可使SOCS3 mRNA表达量下调达80%。系列稀释法检测慢病毒悬液的滴度为1.0×1010TU.L-1。结论运用pRNA-Lenti-GFP载体构建的pRNA-Lenti-SOCS3-GFP慢病毒载体可有效地抑制大鼠SOCS3的表达。大鼠SOCS3基因RNAi慢病毒载体的构建成功,为SOCS3相关疾病的深入研究和治疗奠定基础。

主 题 词：细胞因子信号转导抑制因子3 核糖核酸干扰 慢病毒载体 

学科分类：1001[医学-基础医学] 10[医学] 

D　O　I：10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2010.10.122

馆 藏 号：203818979...