小鼠ERO1α基因慢病毒干扰载体的构建与鉴定

作     者：陈风雷 胡佳慧 戴安娜 刘婉洋 屈玉杏 许显玉 CHEN Feng-lei;HU Jia-hui;DAI An-na;LIU Wan-yang;QU Yu-xing;XU Xian-yu

作者机构：扬州大学兽医学院江苏扬州225009 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 

基　　金：国家自然科学基金项目(31702298) 中国博士后科学基金项目(2017M621843) 江苏省自然科学基金项目(BK20170498) 江苏省高校自然科学研究计划资助项目(17KJD230002) 江苏高校优势学科建设工程资助项目 

出 版 物：《动物医学进展》 (Progress In Veterinary Medicine)

年 卷 期：2019年第40卷第11期

页      码：28-35页

摘      要：针对小鼠ERO1α基因构建短发卡RNA(Short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体。根据NCBI中小鼠ERO1α基因序列,设计3条针对ERO1α的shRNA序列和1条阴性对照shRNA序列。将shRNA序列连接到慢病毒载体pCD513B-U6上,同时进行PCR鉴定及测序,分别命名为pCD513B-ERO1α-shRNA和pCD513B-NC-shRNA。将构建好的重组质粒和包装辅助质粒共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液进行浓缩,同时梯度稀释转导HEK 293T细胞,检测病毒滴度。浓缩后的慢病毒转导RAW 264.7细胞,通过RT-qPCR和Western blot技术进行有效片段的筛选。之后,将筛选的慢病毒转到多种细胞系或者原代细胞,用RT-qPCR和Western blot技术检测ERO1α基因的表达情况。PCR及测序结果表明,重组慢病毒干扰载体pCD513B-ERO1α-shRNA构建成功,所包装的慢病毒其病毒滴度为5×10^7 TU/mL^10×10^7 TU/mL。RT-qPCR和Western blot结果表明,pCD513B-ERO1α-shRNA-3抑制ERO1α表达的效果最好,干扰效率在80%左右。pCD513B-ERO1α-shRNA-3能够转导多种细胞,并显著抑制ERO1α的表达,干扰效率在70%~90%。成功构建针对小鼠ERO1α基因的shRNA重组慢病毒载体,为进一步研究ERO1α功能奠定了技术基础。

主 题 词：内质网氧化还原酶1α 慢病毒载体 shRNA 

学科分类：090601[090601] 09[农学] 0906[农学-水产类] 

D　O　I：10.16437/j.cnki.1007-5038.2019.11.006

馆 藏 号：203820394...