围脂滴蛋白基因CRISPR/Cas9载体的活性分析

作     者：许祥 董维鹏 张少华 冯晨毅 刘田福 燕炯 XU Xiang;DONG Wei-peng;ZHANG Shao-hua;FENG Chen-yi;LIU Tian-fu;YAN Jiong

作者机构：山西医科大学公共卫生学院太原030001 山西医科大学动物实验中心太原030001 

基　　金：山西省国际科技合作项目(2014081050-1) 山西省实验动物资源共享服务平台 山西医科大学科技创新基金项目(01201504) 

出 版 物：《生物技术通报》 (Biotechnology Bulletin)

年 卷 期：2019年第35卷第11期

页      码：89-95页

摘      要：设计并验证能够靶向切割PLIN1基因的sgRNA,为建立高效的PLIN1基因敲除动物模型奠定基础。利用预测软件设计3条评分较好的sgRNA。添加T7启动子后体外转录相应的sgRNA,构建酶切体系并验证其体外切割活性。构建相应的基因敲除质粒载体,通过电转染将质粒转到3T3-L1前脂肪细胞内并进行诱导分化。RT-PCR法检测细胞中PLIN1 mRNA的表达,Western blot法检测细胞中PLIN1蛋白的表达。成功在体外转录3条PLIN1的sgRNA并构建酶切体系,测得sgRNA-PLIN1-1的切割效率为61.8%±9.0%,sgRNA-PLIN1-2的切割效率为64.1%±9.6%,sgRNA-PLIN1-3的切割效率为34.1%±7.2%,sgRNA-PLIN1-3组的切割效率明显低于sgRNA-PLIN1-1组和sgRNA-PLIN1-2组(P<0.05)。成功构建3条sgRNA的质粒载体并电转染进入3T3-L1前脂肪细胞内,转染效率约为30%。诱导分化的第4天,各阳性干扰组PLIN1 mRNA的表达量显著降低(P<0.01);与sgR NA-PLIN1-3组相比,sgRNA-PLIN1-1组和sgRNA-PLIN1-2组PLIN1 mRNA的表达量有显著性差异;各阳性干扰组PLIN1蛋白的表达量显著降低(P<0.01),阳性干扰组相互之间PLIN1蛋白的表达量无显著性差异。3条sgRNA皆可以靶向切割PLIN1基因的2号外显子,其中gRNA-PLIN1-1组和sgRNA-PLIN1-2组的切割活性略高于sgRNA-PLIN1-3组。体外活性切割实验可以很好的预测细胞内切割效果,是筛选高活性sgRNA的有效手段。

主 题 词：PLIN1基因 CRISPR/Cas9 sgRNA 载体构建 切割效率 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 

核心收录：

D　O　I：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2019-0357

馆 藏 号：203823050...