弓形虫腺苷激酶基因的克隆、表达及多抗血清的制备

作     者：李霞 余莉 罗庆礼 乔增培 沈继龙 LI Xia;YU Li;LUO Qing-li;QIAO Zeng-pei;SHEN Ji-long

作者机构：安徽省人兽共患病重点实验室(安徽医科大学)教育部重要遗传病基因资源利用重点实验室合肥230032 安徽中医学院第二附属医院合肥230061 

基　　金：安徽省教育厅自然科学基金资助(No:KJ2008B311) 

出 版 物：《中国人兽共患病学报》 (Chinese Journal of Zoonoses)

年 卷 期：2008年第24卷第6期

页      码：495-499页

摘      要：目的克隆弓形虫RH株腺苷激酶(AK)基因,构建原核表达载体pET28a/AK,表达AK重组蛋白,利用此重组蛋白免疫新西兰白兔制备多抗血清。方法收集、纯化弓形虫RH株速殖子,提取总RNA。设计合成的引物并引入BamHI和XhoI酶切位点,应用RT-PCR扩增弓形虫AK基因片段,目的基因插入克隆载体pGEM-T,提取重组质粒,BamHI和XhoI双酶切获得目的基因,插入原核表达质粒pET28a中,重组子双酶切、PCR和测序鉴定,转化大肠杆菌***21(DE3)并以IPTG诱导表达。亲和层析法纯化重组蛋白抗原,SDS-PAGE和Western blotting验证表达量和免疫活性,免疫新西兰白兔,收集多抗血清,ELISA测定多抗滴度,Western blotting鉴定免疫活性。结果从弓形虫RH株cDNA中扩增出1 092bp的AK目标基因片段,并构建原核表达载体,诱导含pET28a/AK的宿主菌获得了高浓度、与预期分子量大小相符的表达产物,经Ni2+亲和层析法纯化获得了高纯度的rAK蛋白,Western blotting显示rAK能够被TORCH试剂盒中的Tox-IgG阳性控制血清识别,获得了纯化的重组蛋白。rAK蛋白免疫新西兰白兔,获得滴度为1∶106多价抗血清。结论成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取了AK基因,构建了pET28a/AK重组质粒,并获得了高效表达,免疫新西兰白兔获得了高效价多克隆抗体,为弓形虫iRNA及弓形虫病的免疫诊断奠定了基础。

主 题 词：弓形虫 腺苷激酶 基因 克隆 表达 多抗血清 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100201[100201] 10[医学] 

核心收录：

D　O　I：10.3969/j.issn.1002-2694.2008.06.003

馆 藏 号：203825002...