NRSF慢病毒干涉载体的构建及功能初步检测

作     者：杨印祥 李艳华 刘庆斌 张赛男 陈琳 吕洋 白慈贤 南雪 裴雪涛 YANG Yin-Xiang;LI Yan-Hua;LIU Qing-Bin;ZHANG Sai-Nan;CHEN Lin;LU Yang;BAI Ci-Xian;NAN Xue;PEI Xue-Tao

作者机构：军事医学科学院输血医学研究所干细胞与再生医学研究室北京100850 

基　　金：国家高技术研究发展计划(863)领域重大专项资助项目(2006AA02A107) 国家重点基础研究发展计划(973)(2005CB522702) 国家自然科学基金项目(30470831) 

出 版 物：《生物化学与生物物理进展》 (Progress In Biochemistry and Biophysics)

年 卷 期：2008年第35卷第2期

页      码：151-158页

摘      要：为研究神经元限制性沉默因子(NRSF)负调控神经元及胰岛细胞中神经特异性基因的表达,拟通过RNAi的方法降低NRSF表达以进一步观察其调控的下游基因的表达情况.构建含人胰岛素启动子-荧光素酶(HIP-LUC)的pcDNA3.1报告载体.通过RNAi序列设计软件进行NRSF干涉片段及脱靶对照片段的设计,然后构建慢病毒干涉载体.包装产生慢病毒干涉毒液,用其感染HeLa细胞获得稳定干涉NRSF的细胞株,利用RT-PCR、实时定量PCR、蛋白质免疫印迹、免疫荧光染色等方法检测NRSF的干涉效果及其下游基因的表达情况,观察干涉NRSF后胰岛素启动子报告载体荧光素酶活性的变化.构建具有NRSF干涉效果的慢病毒干涉载体成功,并获得了稳定干涉NRSF及脱靶对照的HeLa细胞株,RT-PCR及实时定量PCR检测结果表明,NRSF干涉片段的干涉效率为56%(n=6,P<0.01),蛋白质免疫印迹、免疫荧光染色方法检测证实干涉后NRSF蛋白表达水平明显降低.RT-PCR实验表明干涉NRSF后下游基因开始表达,荧光素酶活性分析表明,干涉NRSF后胰岛素启动子活性增强了2.4倍(n=3,P<0.01).上述结果表明,成功构建NRSF的慢病毒干涉载体并获得稳定干涉NRSF的HeLa细胞株,干涉NRSF后,其下游基因特别是胰岛素基因开始表达.这一研究工作有助于我们进一步了解NRSF在胰岛细胞发育分化中的调控作用.

主 题 词：神经元限制性沉默因子 神经元限制性沉默元件 RNA干涉 胰岛素 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 08[工学] 071009[071009] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 

核心收录：

D　O　I：10.3321/j.issn:1000-3282.2008.02.006

馆 藏 号：203834194...