基因前定点敲入FLAG标签表达的FLAG-SND1蛋白参与胞内应激颗粒的形成

作     者：张楠 崔晓腾 赵春妍 苏超 任媛媛 杨洁 高星杰 ZHANG Nan;CUI Xiao-Teng;ZHAO Chun-Yan;SU Chao;REN Yuan-Yuan;YANG Jie;GAO Xing-Jie

作者机构：天津医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系教育部免疫微环境与疾病重点实验室天津市细胞与分子免疫学重点实验室天津300070 

基　　金：教育部“创新团队发展计划”(No.IRT13085) 国家自然科学基金(No.31670759,31870747,31571380,31701182) 天津市自然科学基金项目(No.18JCQNJC80500)资助~~ 

出 版 物：《中国生物化学与分子生物学报》 (Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology)

年 卷 期：2019年第35卷第12期

页      码：1400-1408页

摘      要：CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas9 nuclease)基因编辑技术是近年来新兴的一种可以实现基因特异性敲除和敲入的技术。本文利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,将3×FLAG标签定点敲入HeLa细胞SND1基因前方,使细胞内源性表达的SND1蛋白带有3×FLAG标签,并观察SND1与应激颗粒及加工体的定位情况。设计针对SND1基因起始密码子ATG附近的sgRNA,以px459为表达载体,构建出重组真核表达质粒。设计含有3×FLAG及待插入位置上下游150 bp同源臂的序列,经公司合成获得重组质粒。将2个质粒共同转染HeLa细胞,使用嘌呤霉素筛选阳性细胞,挑取单克隆后培养。Western印迹表明,细胞表达3×FLAGSND1融合蛋白质。提取细胞基因组DNA进行测序。测序无误获得稳定株后,用流式细胞术检测细胞周期和凋亡,发现与WT细胞相比无显著性差异。同时,使用05 mmol/L亚砷酸钠处理,细胞发生氧化应激,eIF2α蛋白磷酸化增加,胞浆中出现应激颗粒,SND1与应激颗粒标志蛋白TIAR存在共定位现象,但不存在与加工体蛋白DCP1α的共定位。

主 题 词：SND1 CRISPR/Cas9基因编辑系统 HeLa细胞 基因敲入 应激颗粒 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 071010[071010] 081704[081704] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-轻工类] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 

核心收录：

D　O　I：10.13865/j.cnki.cjbmb.2019.10.1247

馆 藏 号：203871820...