鸡Skp2实时荧光定量RT-PCR方法的建立及应用

作     者：吴乐 高海婷 刘超男 高雪丽 张淑君 周放 吕晓萍 边洋 郑世民 WU Le;GAO Haiting;LIU Chaonan;GAO Xueli;ZHANG Shujun;ZHOU Fang;LV Xiaoping;BIAN Yang;ZHENG Shimin

作者机构：东北农业大学动物医学学院黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室 

基　　金：国家自然科学基金项目(31472169) 

出 版 物：《中国家禽》 (China Poultry)

年 卷 期：2019年第41卷第24期

页      码：17-22页

摘      要：为了建立以及应用鸡细胞S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2,Skp2)的实时荧光定量PCR方法,以鸡Skp2基因为研究对象,根据GenBank中已发表的鸡Skp2和β-actin序列的高度保守区域设计引物,构建重组质粒作为标准品,成功建立了检测鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast,CEF)中Skp2 mRNA表达的实时荧光定量RT-PCR方法,并对其Tm值和引物浓度等进行了优化。该方法最优反应体系为20.0μL,包含Real-time PCRMaster mix(2×)10.0μL,上、下游引物(10.0μmol/L)各1.0μL,cDNA 2.0μL,ddH2O 6.0μL;最佳反应条件为95℃预变性10 s,95℃变性5 s,60℃退火/延伸34 s,30个循环。应用该方法对CEF中Skp2 mRNA的表达量进行检测,发现在CEF感染禽网状内皮组织增生病病毒(REV)后,其细胞中Skp2 mRNA表达量均高于对照组,且在24、48、72 h显著增加。研究首次建立了检测鸡Skp2基因的检测方法,该方法稳定性良好,精确度高,特异性强,为进一步定量研究鸡Skp2 mRNA表达及其与细胞周期的关系奠定了基础。

主 题 词：CEF Skp2基因 实时荧光定量PCR REV 

学科分类：090603[090603] 09[农学] 0906[农学-水产类] 

D　O　I：10.16372/j.issn.1004-6364.2019.24.004

馆 藏 号：203880103...