携带cdc2-siRNA重组腺相关病毒的包装

作     者：魏佳军 王卓然 Wei Jia-jun;Wang Zhuo-ran

作者机构：武汉大学人民医院神经内科湖北省武汉市430060 

出 版 物：《中国组织工程研究与临床康复》 (Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research)

年 卷 期：2009年第13卷第28期

页      码：5549-5553页

摘      要：背景:细胞分裂周期2(cell division cycle2,cdc2)在神经变性疾病如阿尔茨海默病的神经元变性过程中扮演了重要角色。以腺相关病毒为载体对cdc2基因进行沉默,可能对神经变性疾病的神经元起保护作用。目的:包装携带cdc2-siRNA的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)。设计、时间及地点:空白对照实验,于2007-10/2008-08在武汉同济医院神经科实验室完成。材料:HelperFree腺相关病毒系统(pAAV-MCS-EGFP、p-RC、p-Helper)及AAV-293细胞为Stratagene公司产品。方法:应用分子生物学方法构建生成pAAV-MCS-U6-cdc2-siRNA-EGFP表达质粒;用磷酸钙法将该质粒和p-RC、p-Helper质粒共转染AAV-293细胞,包装生成携带cdc2-siRNA的重组腺相关病毒(rAAV-U6-cdc2-siRNA-EGFP)。病毒感染AAV-293细胞后行WesternBlot检测cdc2-siRNA对细胞内cdc2基因的沉默效果,并用斑点杂交方法测定该病毒的滴度。主要观察指标:pAAV-MCS-U6-cdc2-siRNA-EGFP质粒中插入片段U6-cdc2-siRNA的测序;3质粒pAAV-MCS-U6-cdc2-siRNA-EGFP、p-RC、p-Helper共转染AAV-293细胞;rAAV-U6-cdc2-siRNA-EGFP感染AAV-293细胞后cdc2的表达。结果:①DNA测序证明U6-cdc2-siRNA已成功构建到表达质粒pAAV-MCS-EGFP中。②AAV-293细胞表达绿色荧光蛋白,共转染成功。③包装得到的重组腺相关病毒(rAAV-U6-cdc2-siRNA-EGFP)感染AAV-293细胞后能显著下调AAV-293细胞cdc2基因的表达量。④rAAV-U6-cdc2-siRNA-EGFP的滴度为1x1012v.g/mL。结论:携带cdc2-siRNA重组腺相关病毒的包装获得成功,它具有沉默cdc2基因表达的功能。

主 题 词：小干扰RNA 重组腺相关病毒 基因治疗 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 0831[工学-公安技术类] 1007[医学-药学类] 0403[0403] 1002[医学-临床医学类] 08[工学] 1010[医学-医学技术类] 0703[理学-化学类] 0836[0836] 

D　O　I：10.3969/j.issn.1673-8225.2009.28.031

馆 藏 号：203880814...